הדמיה בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואקסוציטוזה בזרע עכבר חי

Summary

מודל העכבר AcroSensE ושיטות הדמיה של תאים חיים המתוארים כאן מספקים גישה חדשה לחקר דינמיקת הסידן בתא התת-תאי של אקרוזום הזרע וכיצד הם מווסתים שלבי ביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.

Abstract

אקסוציטוזה אקרוזום (AE), שבה השלפוחית האקזוציטוטית היחידה של הזרע מתמזגת עם קרום הפלזמה, היא תהליך מורכב ותלוי סידן החיוני להפריה. עם זאת, ההבנה שלנו לגבי האופן שבו איתות סידן מווסת AE עדיין אינה שלמה. בפרט, יחסי הגומלין בין דינמיקת הסידן התוך-אקרוזומלית לבין שלבי הביניים המובילים ל-AE אינם מוגדרים היטב. במאמר זה אנו מתארים שיטה המספקת תובנות מרחביות וזמניות על דינמיקת הסידן האקרוזומלית והקשר שלה לאיחוי קרום ולאקסוציטוזה שלאחר מכן של שלפוחית האקרוזומים. השיטה משתמשת בעכבר מהונדס חדשני המבטא חיישן ממוקד אקרוזום לאקסוציטוזה (AcroSensE). החיישן משלב מחוון סידן מקודד גנטית (GCaMP) המאוחה עם mCherry. חלבון היתוך זה תוכנן במיוחד כדי לאפשר תצפית בו זמנית של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואירועי איחוי ממברנה. ניטור בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ו-AE בזרע חי של AcroSensE מושג באמצעות שילוב של הדמיה בקצב פריימים גבוה ומערכת העברת חומרים ממריצים שיכולה להתמקד בזרע יחיד. פרוטוקול זה מספק גם מספר דוגמאות לשיטות בסיסיות לכימות וניתוח הנתונים הגולמיים. מכיוון שמודל AcroSensE מקודד גנטית, ניתן להעצים את חשיבותו המדעית על ידי שימוש בכלים גנטיים זמינים, כגון הכלאה עם מודלים גנטיים אחרים של עכברים או שיטות מבוססות עריכה גנטית (CRISPR). בעזרת אסטרטגיה זו, ניתן לפתור את תפקידיהם של מסלולי איתות נוספים בקיבול הזרע ובהפריה. לסיכום, השיטה המתוארת כאן מספקת כלי נוח ויעיל לחקר דינמיקת סידן בתא תת-תאי ספציפי - אקרוזום הזרע - וכיצד דינמיקות אלה מווסתות את שלבי הביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.

Introduction

הזרע רוכש את היכולת להפרות בתהליך שנקרא קיבול¹. נקודת קצה אחת של תהליך זה היא שהזרע רוכש את היכולת לעבור AE. יותר משני עשורים של נתונים תומכים בנוכחותו של מודל מורכב ורב-שלבי של AE בזרע יונקים (מסוכם^ב-2,3). עם זאת, חקר AE בזרע חי הוא מאתגר, והשיטות הזמינות כיום לניטור תהליך זה ברזולוציה נאותה הן מסורבלות ודורשות שלבי הכנה מרובים⁴, מוגבלות לזיהוי השלב הסופי של AE (למשל, באמצעות PNA⁵), מוגבלות למדידות של שינויים בסידן ציטוסולי (בניגוד לדינמיקה של סידן אקרוזומלי), או מוגבלים למדידות של דינמיקת סידן ציטוסולית או AE⁶.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו תחת ההנחיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קורנל (#2002-0095). עכברי AcroSensE^בני 8-10 שבועות 2 שימשו במחקר הנוכחי. בקשות למידע על זמינותם של עכברי AcroSensE ניתן להגיש למחבר המתאים.

1. איסוף זרע ושטיפתו

Discussion

כאן, מתוארת שיטה מבוססת מיקרוסקופיה המשתמשת במודל העכבר החדש שנוצר AcroSensE לניטור וניתוח בזמן אמת, תא בודד של יחסי הגומלין בין דינמיקת סידן אקרוזומלית ושלבי ביניים המובילים ל- AE. יחד עם גישות גנטיות זמינות, כגון הכלאה עם מודלים גנטיים אחרים של עכברים או עריכת גנים, מודל ושיטה אלה מספקים מערכת.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III