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Il modello murino AcroSensE e i metodi di imaging di cellule vive qui descritti forniscono un nuovo approccio allo studio della dinamica del calcio nel compartimento subcellulare dell'acrosoma spermatico e di come regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.
L'esocitosi acrosomica (AE), in cui la singola vescicola esocitotica dello spermatozoo si fonde con la membrana plasmatica, è un processo complesso e calcio-dipendente essenziale per la fecondazione. Tuttavia, la nostra comprensione di come la segnalazione del calcio regoli l'AE è ancora incompleta. In particolare, l'interazione tra la dinamica del calcio intra-acrosomiale e le fasi intermedie che portano all'AE non è ben definita. Qui, descriviamo un metodo che fornisce approfondimenti spaziali e temporali sulla dinamica del calcio acrosomiale e sulla loro relazione con la fusione di membrana e la successiva esocitosi della vescicola acrosomiale. Il metodo utilizza un nuovo topo transgenico che esprime un sensore per l'esocitosi mirato all'acrosoma (AcroSensE). Il sensore combina un indicatore di calcio geneticamente codificato (GCaMP) fuso con mCherry. Questa proteina di fusione è stata specificamente progettata per consentire l'osservazione simultanea della dinamica del calcio acrosomiale e degli eventi di fusione della membrana. Il monitoraggio in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell'AE negli spermatozoi vivi AcroSensE si ottiene utilizzando una combinazione di imaging ad alta frequenza di fotogrammi e un sistema di somministrazione stimolante in grado di colpire singoli spermatozoi. Questo protocollo fornisce anche diversi esempi di metodi di base per quantificare e analizzare i dati grezzi. Poiché il modello AcroSensE è geneticamente codificato, il suo significato scientifico può essere aumentato utilizzando strumenti genetici prontamente disponibili, come l'incrocio con altri modelli genetici murini o metodi basati sull'editing genetico (CRISPR). Con questa strategia, è possibile risolvere il ruolo di ulteriori vie di segnalazione nella capacitazione e nella fecondazione degli spermatozoi. In sintesi, il metodo qui descritto fornisce uno strumento conveniente ed efficace per studiare la dinamica del calcio in uno specifico compartimento subcellulare - l'acrosoma spermatico - e come tali dinamiche regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.
Gli spermatozoi acquisiscono la capacità di fecondare durante un processo chiamato capacitazione1. Un endpoint di questo processo è che gli spermatozoi acquisiscono la capacità di sottoporsi a AE. Oltre due decenni di dati supportano la presenza di un modello complesso e multi-step di AE negli spermatozoi dei mammiferi (riassunto in 2,3). Tuttavia, lo studio dell'AE negli spermatozoi vivi è impegnativo e i metodi attualmente disponibili per monitorare questo processo con una risoluzione adeguata sono ingombranti e richiedono più fasi di preparazione4, sono limita....
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le linee guida e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Cornell University (#2002-0095). Per il presente studio sono stati utilizzati topi AcroSensE2 di 8-10 settimane. Le richieste di informazioni sulla disponibilità dei topi AcroSensE possono essere inoltrate all'autore corrispondente.
1. Raccolta e lavaggio degli spermatozoi
La Figura 2 fornisce un'illustrazione semplificata che mostra la sequenza di cambiamenti di fluorescenza previsti dopo la stimolazione riuscita degli spermatozoi. Il pannello superiore della Figura 2 illustra i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza GCaMP3, dove il segnale è inizialmente debole (le concentrazioni di calcio acrosomiale al basale sono inferiori a GCaMP3 KD) e all'ingresso di ioni calcio attraverso i pori di fusione, la fluorescen.......
Qui, viene descritto un metodo basato sulla microscopia per utilizzare il modello murino AcroSensE appena generato per il monitoraggio in tempo reale di una singola cellula e l'analisi dell'interazione tra la dinamica del calcio acrosomiale e i passaggi intermedi che portano all'AE. Insieme ad approcci genetici prontamente disponibili, come l'incrocio con altri modelli genetici murini o l'editing genetico, questo modello e metodo forniscono un potente sistema per studiare il ruolo di vari componenti e percorsi che prendo.......
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni R01-HD093827 e R03-HD090304 (A.J.T) del National Institutes of Health.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
CaCl2 | Sigma | C4901 | |
Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
Glucose | Sigma | G7528 | |
Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
HEPES | Sigma | H7006 | |
ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
KCl | Sigma | P9541 | |
Lactic acid | Sigma | G5889 | |
Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
NaCl | Sigma | S3014 | |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
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