Cristalização e Coleta de Dados de Temperatura Ambiente In Situ Usando a Instalação de Cristalização em Harwell e Linha de Luz VMXi, Fonte de Luz Diamante

Summary

Apresentamos um protocolo para a cristalização de proteínas usando a instalação de cristalização no Complexo de Pesquisa em Harwell e subsequente coleta de dados cristalográficos de raios X in situ de cristais dentro das placas na linha de luz Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) de Diamond. Descrevemos os requisitos da amostra, protocolos de cristalização e diretrizes de coleta de dados.

Abstract

Protocolos para cristalização robótica de proteínas usando a Instalação de Cristalização em Harwell e coleta de dados de temperatura ambiente in situ de placas de cristalização na linha de luz VMXi da Diamond Light Source são descritos. Essa abordagem permite que estruturas cristalinas à temperatura ambiente de alta qualidade sejam determinadas a partir de múltiplos cristais de maneira direta e fornece feedback muito rápido sobre os resultados dos ensaios de cristalização, além de permitir a cristalografia seriada. O valor das estruturas à temperatura ambiente na compreensão da estrutura de proteínas, ligação de ligantes e dinâmica está se tornando cada vez mais reconhecido na comunidade de biologia estrutural. Este pipeline é acessível a usuários de todo o mundo com vários modos de acesso disponíveis. Os experimentos de cristalização configurados podem ser visualizados remotamente com cristais identificados automaticamente usando uma ferramenta de aprendizado de máquina. Os dados são medidos em um sistema baseado em filas com conjuntos de dados de rotação de até 60° a partir de cristais selecionados pelo usuário em uma placa. Os dados de todos os cristais dentro de um poço específico ou grupo de amostra são automaticamente mesclados usando xia2.multiplex com as saídas acessadas diretamente através de uma interface de navegador da web.

Introduction

A cristalografia de raios X continua sendo uma ferramenta chave para a compreensão da estrutura e função de proteínas, fornecendo estruturas de alta resolução de proteínas ou seus complexos com, por exemplo, substratos ou candidatos a fármacos. Em muitos casos, no entanto, a obtenção de cristais com propriedades desejáveis - forma cristalina altamente difratizante e passível de embebição e sem patologias cristalinas como geminação - continua sendo um gargalo considerável¹. Como as condições químicas adequadas para produzir cristais de proteína não podem, em geral, ser previstas, a triagem de cristalização explorando milhares de misturas químicas potenciais é padrão, muitas vezes auxiliada por automação/robótica na configuração de telas e hotéis de cristais para monitorar, muitas vezes remotamente, as imagens de gotas de cristalização que são registradas.

Quando os cristais aparecem, normalmente eles devem ser colhidos do ambiente de cristalização usando um laço de nylon ou Kapton e, em seguida, transferidos para uma gota contendo um agente de crioproteção (cuja busca é uma variável adicional) antes de mergulhar no congelamento em nitrogênio líquido. Essas etapas adicionais entre a cristalização e a coleta de dados de raios-X podem envolver desidratação da gota de cristalização quando seu ambiente selado é quebrado, tensões mecânicas no cristal quando ele é manuseado e danos dos agentes crioprotetores à rede cristalina (tipicamente resultando em maior espalhamento do mosaico), entre outros fatores². Além disso, a colheita de cristais é intensiva em tempo e trabalho e pode levar à não homogeneidade entre as amostras, especialmente quando a pele se forma em gotas durante o processo de colheita. A linha de luz VMXi dá acesso a dados utilizáveis de cristais que estão presos à placa, que de outra forma seriam descartados para coleta de dados.

A grande maioria das estruturas cristalinas de raios X são determinadas a 100K usando a abordagem acima, permitindo o transporte e manuseio de cristais simples e aumentando a vida útil do cristal no feixe de raios X em ordens de magnitude. Há interesse crescente, entretanto, na determinação de estruturas sob condições não criogênicas, ou seja, muito mais próximas das condições fisiológicas relevantes para a função proteica ^2,3,4. Isso permite uma melhor apreciação da estrutura dinâmica das proteínas, evita que conformações ou alças de aminoácidos sejam congeladas em estados funcionalmente não relevantes⁵ e permite que a ligação do ligante seja explorada em condições muito mais próximas daquelas no ambiente natural da proteína dentro da célula e do organismo⁶.

Uma abordagem alternativa, implementada na linha de luz Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) do síncrotron Diamond Light Source, Reino Unido, é medir os dados de difração diretamente dos cristais dentro do ambiente em que cresceram (ou seja, dentro da placa de cristalização), sob condições ambientais e sem perturbação ^7,8. Isso permite um feedback muito rápido de telas de cristalização e otimizações para guiar um usuário a uma forma de cristal ideal para suas necessidades. Também permite que estruturas de temperatura ambiente de alta qualidade sejam produzidas de forma automatizada⁹.

Este protocolo assume que um usuário tem uma amostra de proteína altamente pura pronta para cristalização. Descrevemos a experiência do usuário acessando o Crystallization Facility em Harwell para produzir cristais de proteína e, em seguida, usar a linha de luz VMXi para coleta de dados (Figura 1).

A instalação de cristalização em Harwell

A Instalação de Cristalização em Harwell (CF) está localizada no Complexo de Pesquisa em Harwell (RCaH) adjacente à Fonte de Luz de Diamante. A instalação oferece aos usuários um laboratório automatizado de alto rendimento para cristalização de macromoléculas, usando robótica para triagem de cristalização, otimização de cristais, imagens de cristais e caracterização. Através da estreita integração com a linha de luz VMXi altamente automatizada, o ritmo de determinação de estruturas de temperatura ambiente acelerou muito e permite a caracterização de novas estruturas de proteínas, complexos proteína-ligante e DNA-ligante, bem como triagem automatizada de fragmentos (Figura 1), tudo sob condições não criogênicas.

O pipeline CF é um conjunto de instrumentação que engloba robôs de cristalização de nanolitros⁹ para a cristalização de proteínas solúveis e de membrana, robôs de manuseio de líquidos para preparar telas de cristalização comerciais e telas de otimização personalizadas complexas, e quatro instrumentos de imagem (um a 4 °C e três a 20 °C para a imagem de placas de cristalização (veja a Tabela de Materiais). Um imageador é capaz de obter imagens de placas de vidro de fase cúbica lipídica (LCP) e um imageador é equipado com óptica de multifluorescência (ambos a 20 °C).

A instalação agora é amplamente utilizada por um amplo espectro de usuários acadêmicos e industriais, incluindo o Laboratório de Proteínas de Membrana (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), a instalação de triagem de fragmentos ^{XChem 10}, as linhas de luz MX, o XFEL-hub, bem como o Instituto Rosalind Franklin (RFI). Este pipeline bem estabelecido e otimizado permitiu que experimentos de cristalização fossem realizados em um amplo espectro de projetos de biologia estrutural. Este artigo descreve o pipeline para cristais destinados à coleta de dados no VMXi, embora os cristais também possam ser colhidos e crio-resfriados ou direcionados para o pipeline XChem.

O acesso do usuário é alocado através do sistema de proposta Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) e os usuários industriais são apoiados através do grupo Diamond Industry Liaison. Todos os usuários podem chegar ao local com sua(s) amostra(s) ou placas, que podem ser transportadas à mão. Não é recomendado o envio de placas por correio, pois nossa experiência sugere que as gotas podem se afastar do local em que foram dispensadas, ou as gotas podem ser danificadas pelo reservatório de cristalização. Alternativamente, por acordo, os usuários podem enviar suas amostras de proteína para a FC, onde membros da equipe montam experimentos de cristalização em seu nome. Os experimentos podem ser monitorados remotamente pelo usuário fazendo login no Rock Maker Web no caso do CF ou via ISPyB no caso do VMXi. O acesso ao FC pode ser realizado de forma iterativa com base nos resultados de difração de raios X coletados no Diamond.

Linha de Luz VMXi na Diamond Light Source

A linha de luz VMXi (doravante referida como "a linha de luz") é um instrumento único e recentemente desenvolvido totalmente dedicado à cristalografia de raios X altamente automatizada à temperatura ambiente com foco na medição de dados de cristais dentro de placas de cristalização adequadas. A linha de luz oferece um microfoco (10 x 10 μm), feixe rosa (passagem de banda de <5 × ^10-2ΔE/E) com um alto fluxo de ~2 × 10¹³ fótons/s (a 16 KeV)⁷. Este feixe de alto fluxo, juntamente com um detector rápido, permite um rendimento muito alto de amostras e coleta de dados de amostras com mais de 10 μm de tamanho.

As placas de cristalização entram na linha de luz sendo armazenadas em um sistema de armazenamento de amostras e fotografadas com base no cronograma fornecido pelo usuário durante o registro das placas usando a interface ISPyB¹¹ SynchWeb¹². Normalmente, os usuários são aconselhados a selecionar uma sequência de pontos de tempo de Fibonacci para aquisição de imagens (0, 12, 24, 36, 60... 7.320 h da placa que está sendo inserida no sistema). O usuário é informado por e-mail assim que uma placa é fotografada. Tanto a luz visível quanto a imagem UV estão disponíveis para os usuários sob demanda. As imagens captadas pelo sistema de armazenamento de amostras são analisadas por um algoritmo de aprendizado de máquina; Isso localiza e define automaticamente pontos de interesse de objetos que se assemelham a cristais e registra os pontos de interesse prontos para o usuário adicionar a uma fila para coleta de dados. Os usuários também podem clicar manualmente nas imagens de luz visível para registrar pontos de interesse ou podem clicar e arrastar uma região a ser analisada por varredura raster. Esses pontos estão disponíveis para os usuários adicionarem à fila ao lado dos pontos localizados automaticamente.

Uma vez que todas as amostras tenham parâmetros apropriados para a coleta de dados, a placa entra em uma fila. Quando a placa atinge o topo da fila, ela é automaticamente dispensada para a linha de luz. As placas de cristalização são carregadas dos hotéis de cristal para a linha de luz automaticamente por um braço robótico e, após a correspondência de imagens, conjuntos de dados cristalográficos de até 60° de rotação são medidos a partir de cada cristal selecionado de acordo com as instruções definidas pelo usuário. Todas as gotas dentro de uma placa podem ser usadas para esses experimentos na linha de luz. Os dados são mesclados a partir de múltiplos cristais para produzir conjuntos de dados isóficos e otimizados de forma automatizada ^7,9. Uma vez que todos os conjuntos de dados em fila são coletados, o usuário recebe um e-mail com um link a ser seguido para visualizar os conjuntos de dados no ISPyB¹¹, como em outras linhas de luz Diamond MX. Os usuários também são direcionados para a página web da linha de luz (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

Protocol

1. Produzindo cristais dentro de placas in situ usando a Instalação de Cristalização em Harwell

NOTA: O acesso ao CF é suportado por várias rotas diferentes e depende da aplicação do projeto e do tipo de usuário (acadêmico ou industrial). Os projetos XChem e MPL têm seu próprio sistema de solicitação de propostas através do Sistema de Administração de Usuários (UAS) e podem ser enviados através da rota de acesso padrão (incluindo iNEXT Discovery e EUbOPEN) ou BAG Access. O protocolo abaixo é específico para usuários VMXi.

1. Submissão de propostas e preparação para a visita
   1. Forneça informações sobre o projeto a um aplicativo de proposta BAG ou adicione-o a uma proposta BAG ativa. Geralmente há um coordenador do BAG, que organiza a papelada. Alternativamente, envie uma proposta de acesso rápido para acesso à linha de luz.
   2. Certifique-se de que a amostra foi registrada e a segurança validada no UAS em uma proposta antes da chegada ao local, seja por correio ou pessoalmente.
   3. Verifique se o usuário está registrado (com FedID e senha).
   4. Verifique se o usuário foi adicionado a uma proposta MX como associado no UAS pelo coordenador do BAG.
   5. Preencha o formulário de detalhes da amostra de cristalização da linha de luz e envie o formulário para VMXi@diamond.ac.uk.
   6. Comunique-se com a equipe da linha de luz sobre os requisitos do experimento e a disponibilidade da linha de luz.
   7. Se as amostras de proteína forem enviadas, só envie amostras mediante acordo prévio. Consulte a seção 1.2 para obter detalhes.
   8. Se o usuário for entrar no local para instalar placas de cristalização no CF, verifique com a equipe da instalação sobre a disponibilidade de um intervalo de tempo para usar a instrumentação da instalação e siga a seção 1.2.1.
   9. Se o usuário trouxer placas para o local, certifique-se de que a amostra seja dispensada no tipo de placa correto e coloque as gotas de cristalização no local correto e na quantidade correta. Siga a seção 1.2.2. A linha de luz aceita apenas placas de cristalização in situ específicas (Greiner CrystalQuickX e MiTeGen In Situ-1); garantir que as gotas não sejam maiores do que 200 nL.
2. Experimento de cristalização conduzido em FC
   NOTA: A instalação oferece uma série de métodos de cristalização macromolecular de alto rendimento, como difusão de vapor, bem como cristalização em batelada sob óleo e LCP. Recomenda-se iniciar com 70-100 μL de proteína pura e realizar experimentos de difusão de vapor para proteínas solúveis com três telas, usando uma proporção de 100 nL de solução proteica e 100 nL de solução reservatório de cristalização e incubando as placas a 20 °C. Uma série de telas comerciais estão disponíveis dentro da instalação. O controle de umidade e temperatura está disponível com 4 °C e 20 °C mais utilizados. Os usuários que visitarem o CF receberão treinamento padronizado e suporte para operar a instrumentação de cristalização e usarão as configurações aqui descritas.
   1. Envio de amostras para montagem no CF
      NOTA: Antes da chegada ao local, a amostra de proteína deve ter sido validada em uma proposta dentro do sistema UAS. Assim que a amostra de proteína chegar ao local, os membros da equipe montarão experimentos de cristalização conforme instruído em comunicações anteriores com o usuário. A confirmação será enviada via E-mail com as informações do código de barras para as placas de cristalização experimentais. O usuário será solicitado a adicionar as placas de cristalização como recipientes à proposta relevante. Feito isso, as placas podem ser armazenadas em imageadores automatizados na instalação de cristalização ou na linha de luz. ISPyB será a interface utilizada para interação na linha de luz.
      1. Fornecer a solução da amostra de proteína na concentração para cristalização em alíquotas de 25 μL. Rotular claramente os tubos de amostra que contêm a amostra de proteína.
      2. Se necessário, forneça uma solução tampão de proteína, solução de ligante ou solução de reservatório.
      3. Informe o pessoal da instalação sobre quais telas e taxas de queda devem ser usadas.
   2. Configurações da placa de cristalização
      NOTA: Exigimos que as gotas de cristalização na placa Greiner CrystalQuickX e MiTeGen In Situ-1 estejam em um local específico; placas configuradas em outro lugar devem usar as seguintes configurações do Mosquito¹³ descritas aqui.
      1. Para ajustar a definição da placa para MiTeGen In Situ-1, abra o software Mosquito SPT e clique na página de definição de placa MiTeGen In Situ-1 padrão clicando em Configuração | 96 Poço | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 gotas) (Figura 2A). Clique no botão de edição e altere os valores para a localização do subpoço 2: X Offset para - 1.2 e Y Offset para 1.8 e para a localização do subpoço 3: X Offset para 1.3 e Y Offset para 1.8 (Figura 2B,C).
      2. Para ajustar a definição da placa para Greiner CrystalQuickX, abra o software Mosquito SPT e clique na página de definição de placa Greiner CrystalQuickX padrão clicando em Configuração | 96 Poço | Greiner CrystalQuickX (Figura 2D). Clique no botão de edição e altere os valores para a localização do subpoço 1: X Offset para - 1,95 e Y Offset para 1,45 e para a localização do subpoço 2: X Offset para 1,95 e Y Offset para 1,45 (Figura 2E,F).

2. Usando a linha de luz na fonte de luz de diamante

NOTA: Toda a interação com a linha de luz pelos usuários é realizada remotamente usando a interface ISPyB¹¹ . Nenhuma presença física na linha de luz é necessária e os dados são coletados usando um sistema baseado em filas, em vez de serem programados em um momento específico. Os usuários terão uma proposta associada ao seu acesso à Diamond Light Source. Na linha de luz, a cada placa de cristalização é atribuída uma visita única e é definida como um 'recipiente' dentro do ISPyB¹¹ análogo a um puck contendo amostras a 100 K. As telas de otimização não podem ser criadas usando a interface SynchWeb e, como tal, as informações são normalmente adicionadas à seção de comentários (veja a etapa 2.1.4.). O indivíduo que cadastrar a placa precisará verificar o endereço de e-mail, pois o proprietário da placa receberá e-mails sobre imagens e notificações preenchidas da placa.

1. Placas de registro
   1. Faça login no ISPyB com um Diamond FedID apropriado e selecione Propostas. Pesquise a proposta de interesse rolando ou digitando o número da proposta na barra de pesquisa. Selecione Remessa no menu suspenso sob o número da proposta (Figura 3A), que abrirá a janela Remessas com as remessas nessa proposta. Clique em +Add shipment no canto superior direito (Figura 3B) para abrir a janela Add New Shipment , dê um Nome à remessa, clique em Automated/Imager e clique no botão Add Shipment no canto inferior esquerdo (Figura 3C).
   2. Na janela de remessa (Figura 3D), clique em +Add Container, que exibirá a exibição de página Add container (Figura 3E). Escolha no menu suspenso Tipo de contêiner um dos tipos de placa relevantes. A página será alterada para refletir o tipo de contêiner escolhido. Insira um nome de código de barras e contêiner de acordo com as instruções de e-mail da equipe da linha de luz específica para as placas experimentais. Observe que ele diferencia maiúsculas de minúsculas.
   3. Selecione o imageador VMXi 20 °C no menu suspenso Requested Imager , o agendamento de imagens de Fibonacci no menu suspenso Imaging Schedule , a tela de cristalização no menu suspenso Crystallization Screen e o nome de usuário no menu suspenso Owner , clique no botão View e insira o endereço de e-mail de contato correto na caixa Email (Figura 3F).
   4. Insira mais detalhes sobre a placa na caixa Comentários . Selecione a amostra relevante no menu suspenso Proteína e use a sigla registrada no UAS e aprovada pela Diamond dentro da proposta experimental. Digite o mesmo nome na caixa Nome da amostra ; Deixe as caixas restantes vazias.
   5. Clique no ícone +Placa para replicar a amostra em toda a placa e preencher todo o recipiente com quadrados verdes. Clique em +Adicionar recipiente na parte inferior da página para registrar a placa. Peça a um membro da equipe da linha de luz que transfira a placa para o imageador apropriado, onde será armazenada e fotografada. Uma visita será gerada quando o contêiner estiver armazenado nos imageadores e o usuário receberá um e-mail com um link para a placa e suas imagens.
2. Exibindo resultados de imagens
   1. Navegue até a proposta de interesse (etapas 2.1.1), selecione Contêineres no menu suspenso sob o número da proposta e observe a lista de contêineres disponíveis para a proposta. Selecione o filtro Placas se outros tipos de porta-amostras estiverem presentes. Para restringir ainda mais a pesquisa, marque a caixa Meus Contêineres para exibir apenas os contêineres mais relevantes associados ao ID de usuário conectado atual. Clique no contêiner apropriado movendo o cursor sobre a linha individual e clicando com o botão esquerdo do mouse.
   2. Ao selecionar o recipiente, uma nova visão será apresentada, mostrando uma visão geral da placa (Figura 4A). Clique em uma gota na representação da placa no lado esquerdo da tela para mostrar a imagem mais recente dessa respectiva gota. Use as teclas de seta para navegar entre as quedas ou selecione quedas individuais usando um mouse/cursor.
   3. Para visualizar imagens históricas de uma gota, clique no botão H e aguarde até que uma galeria pop-up de imagens apareça sobre a imagem atual do poço. Passe o cursor sobre as imagens individuais para atualizar a imagem de soltar principal.
   4. Classifique imagens para indicar o status de cada gota pressionando os botões 0 - 9 . Para ver as categorias individuais, abra o menu suspenso Pontuação no canto superior esquerdo da imagem suspensa. Procure cruzes azuis em cada uma das imagens de queda, que são resultado de um algoritmo (CHiMP) treinado para procurar "cristais" dentro das imagens.
   5. Clique no terceiro botão de ícone chamado Medir no canto superior direito da imagem de queda para acessar uma ferramenta de medição. Para usar essa ferramenta, clique e arraste uma linha, e uma régua estenderá e dará a distância em μm.
   6. Para solicitar uma sessão de imagem adicional, clique em Visível ou UV na caixa suspensa adjacente ao cabeçalho Ações na parte inferior da página. Em seguida, clique no botão Solicitar imagem da placa .
3. Seleção de cristais/CHiMP
   1. Para adicionar pontos para coleta de dados manualmente, pressione o botão +Marcar Ponto . Passe o cursor sobre o ponto de interesse desejado e selecione. Espere que uma cruz vermelha apareça.
      Observação : até 100 objetos podem ser criados por gota.
   2. Quando todos os pontos estiverem marcados, clique no botão +Concluir . Lembre-se de também clicar no botão +Concluir antes de tentar medir objetos. Para adicionar regiões para coleta de dados por meio de varreduras de grade, clique no botão +Marcar região . Clique no ponto superior esquerdo e arraste para baixo e para a direita para criar uma região que será varrida raster na linha de luz. Assim como acontece com os pontos, clique no botão +Concluir quando todas as regiões desejadas forem criadas.
      NOTA: É melhor criar uma região maior do que muitas regiões pequenas.
   3. Observe as cruzes azuis já nas imagens de queda, que são o resultado de um algoritmo projetado para localizar automaticamente objetos cristalinos (CHiMP). Para visualizar a avaliação CHiMP de quedas de cristalização, clique na caixa de seleção Mostrar pontuações automáticas e, em seguida, altere o menu suspenso para Classe. Normalmente, a configuração mais útil aqui é a opção de cristal (Figura 4B).
      NOTA: Este é um novo recurso e não é garantido encontrar todos os cristais e também pode encontrar outros objetos que não são cristais.
   4. Quando todos os pontos e regiões tiverem sido marcados nas respectivas opções, clique no botão Preparar para a Coleta de Dados na parte inferior da página.
4. Preparando amostras para coleta de dados
   1. Observe a lista de amostras contendo os pontos ou regiões selecionados na etapa anterior, ou localizadas automaticamente (Figura 4C). Adicione pontos ou regiões individuais pressionando o botão + ou adicione todas as amostras exibidas clicando no botão Adicionar página atual à fila .
   2. Os filtros estão disponíveis para mostrar apenas Ponto, Região, Pontos automáticos ou Pontos manuais . Para mostrar apenas as amostras que não foram filmadas (ou seja, expostas a raios-X), clique nas opções Sem Dados e Não Concluídas acima dos botões de filtro.
   3. Selecione amostras individuais clicando na respectiva linha e atualize a imagem no lado direito da tela para mostrar a queda correta e o ponto individual. Se houver muitas amostras na lista, aumente o número de amostras exibidas por página selecionando o menu suspenso com 10 como padrão e até 100 como o número máximo de amostras exibidas.
   4. Depois que todos os pontos e regiões tiverem sido adicionados à fila, certifique-se de que todos os parâmetros de coleta de dados experimentais estejam associados a cada experimento.
      1. Use filtros para Ponto, Região, Manual e Automático. Clique no filtro Ponto e clique na caixa de seleção Selecionar tudo abaixo dos botões de filtro para aplicar parâmetros simultaneamente a todas as amostras visíveis na lista atual Amostras em fila .
      2. Selecione os parâmetros experimentais no menu suspenso no lado direito da tela, abaixo da foto de soltar (Figura 4D). Para regiões, selecione a opção de Grid Scan DMM 10 micron steps, 100 por cento de transmissão. Para todos os outros experimentos pontuais , selecione outras opções no menu suspenso, conforme apropriado.
      3. Para coletas de dados de oscilação, clique na opção de transmissão Omega Scan DMM 60 graus 5% para coletar a quantidade máxima de dados de uma amostra individual. Aplique pequenas rotações para cristais muito pequenos ou amostras sensíveis à radiação e varie a transmissão com base na experiência anterior com uma forma de cristal específica. Depois que todas as amostras tiverem parâmetros experimentais aplicados corretamente, clique no botão Contêiner de fila na parte inferior da página.
   5. Uma vez que a placa tenha atingido o topo da fila, ela será apresentada à linha de luz, os conjuntos de dados serão coletados e, em seguida, retornará novamente ao armazenamento da amostra dentro da linha de luz. Uma vez concluída a coleta de dados de uma placa, procure um e-mail com um link a seguir para acessar os dados relevantes.
5. Criando grupos de exemplo
   Observação : grupos de amostra podem ser criados para agrupar amostras semelhantes em várias gotas ou placas. Todos os conjuntos de dados dentro desses grupos de amostra serão processados usando o pipeline xia2.multiplex¹⁴ uma vez processados por DIALS. Isso pode ser útil ao coletar muitas cunhas muito pequenas de dados e também pode ser útil para aumentar o sinal-ruído para experimentos de ligação de ligantes.
   1. Selecione Gerenciamento de Grupo de Amostra no menu suspenso abaixo do número da proposta. Procure uma lista de grupos se eles já tiverem sido criados por outros usuários. Para gerar um novo grupo, clique no botão +Criar Grupo de Exemplo . Clique em uma remessa no menu suspenso na página Create Sample Group para ver o visualizador de exemplo (Figura 5A). Clique no contêiner que contém as amostras relevantes da lista preenchida.
   2. Quando um contêiner tiver sido clicado, procure um gráfico mostrando a visão geral da placa.
   3. Clique em soltas individualmente clicando na gota individual (Figura 5B) ou clique em soltas em linhas ou colunas clicando na letra de linha ou no número de coluna relevante. Quando todos os poços associados a um grupo individual tiverem sido selecionados, digite um nome para o grupo na caixa Nome do Grupo de Amostra e clique no botão Salvar Grupo de Amostra . Clique no botão View Sample Groups nesta página para retornar à lista de grupos de exemplo já gerados associados à proposta (Figura 5C).
6. Editando grupos de exemplo
   1. Clique em um grupo de exemplo na lista de grupos na página Gerenciamento de Grupo de Exemplo .
   2. Clique no botão +Edit Sample Group adjacente aos contêineres que aparecem abaixo das informações do grupo (Figura 5C).
   3. Observe as gotas, já associadas a um grupo amostral, destacadas na visão geral da placa.
   4. Adicione mais gotas ao grupo de exemplo clicando em gotas, poços ou colunas como antes.
      Observação : descartáveis não podem ser removidos de um grupo de exemplo.
   5. Depois que outras opções forem adicionadas, edite o Nome do Grupo de Exemplo e salve-o ou salve-o clicando no botão Salvar Grupo de Amostra .
7. Visualizando e analisando a saída de grupos amostrais
   1. Clique em um grupo individual na lista de grupos de exemplo para exibir a visão geral da placa do contêiner ou contêineres associados ao grupo. As gotas incluídas no grupo serão destacadas neste display (Figura 5D).
   2. Procure uma lista contendo os últimos três trabalhos multiplex cronológicos se os dados tiverem sido coletados nesse grupo.
   3. Clique na linha de uma execução multiplex para atualizar os resultados de processamento abaixo.
   4. Observe o botão de link rápido , que mostra o número de conjuntos de dados associados ao grupo. Clique nesse botão para abrir uma nova página Coleções de Dados exibindo as coleções de conjuntos de dados individuais.

3. Acesso ao processamento automático de dados

NOTA: Uma vez que os dados foram coletados, eles são passados através de vários pipelines de processamento de dados automáticos. Os quatro dutos padrão usados nas linhas de luz MX em Diamond também são executados em dados coletados na linha de luz. São eles 'fast_dp', 'xia2 dials', 'xia2 3dii' e '^autoPROC'15. O 'fast_dp' proporcionará uma rápida redução de dados para avaliar rapidamente a qualidade. Os outros três pipelines exigirão mais tempo de computação e executarão uma variedade de diferentes pacotes de software de redução de dados para comparação. Assim, a saída é geralmente de qualidade superior à saída 'fast_dp'. Os conjuntos de dados coletados na linha de luz também serão executados através do software de fusão automática de múltiplos cristais 'xia2.multiplex'14, que mesclará todos os conjuntos de dados dentro de um grupo definido. Observe que, embora as varreduras de grade não sejam processadas automaticamente, os dados podem ser processados manualmente usando o pipeline 'xia2.ssx'. Os resultados dos pipelines de processamento automático podem ser encontrados no ISPyB¹¹ usando o seguinte protocolo.

1. Localizando os conjuntos de dados
   1. Faça login no ISPyB conforme descrito acima e selecione Propostas.
   2. Pesquise a proposta de interesse rolando ou digitando o número da proposta na barra de pesquisa.
   3. Clique na visita desejada na lista que aparece na tela para acessar a janela Coleções de Dados dessa visita.
   4. Aplique os filtros desejados.
      Observação : um filtro popular é o filtro 'Auto Integrado', que exibirá apenas conjuntos de dados que foram executados com êxito através de um ou mais pipelines de processamento. Isso excluirá as varreduras de grade, pois elas não são processadas automaticamente por meio do ISPyB.
   5. Role a página para baixo para encontrar o conjunto de dados de interesse.
      NOTA: Cada conjunto de dados exibirá o ID da amostra, os parâmetros experimentais usados, um visualizador de imagem de difração, um visualizador de imagem de cristal e um gráfico de análise por imagem para rápida observação da qualidade dos dados.
2. Para acessar os resultados do processamento automático
   1. Clique na guia Processamento automático abaixo do resumo de dados de um experimento específico para inspecionar os resultados da redução automática de dados (Figura 6A).
   2. Clique nas diferentes guias correspondentes aos diferentes pipelines para ver um resumo detalhado de cada saída.
      Observação : se grupos de exemplo foram definidos, haverá duas guias correspondentes a trabalhos multiplex. Um corresponderá à mesclagem de todos os conjuntos de dados no grupo até aquele ponto, enquanto o outro corresponderá à mesclagem de conjuntos de dados somente dentro dessa queda.
   3. Clique no botão Logs & Files para baixar os arquivos .mtz resultantes se o processamento foi bem-sucedido e quaisquer arquivos de log associados. Clique na guia Processamento Downstream abaixo da seção Auto Processing para visualizar a saída da DIMPLE.
      Observação : DIMPLE só será executado se um arquivo PDB foi fornecido durante o envio de exemplo.
   4. Clique no botão Logs & Files para baixar qualquer saída resultante do DIMPLE.
3. Para acessar os resultados do multiplex de grupo, abra o menu suspenso na parte superior da tela com o número da proposta escrito nele e clique em Gerenciamento de Grupo de Amostra. Clique na linha correspondente ao grupo desejado dentro do contêiner correto. Role para baixo para encontrar a lista de saídas multiplex correspondentes ao grupo, conforme representado visualmente por um diagrama da placa.
   1. Clique na saída multiplex desejada na lista fornecida. Clique no botão xxx Data Sets , onde xxx é o número de conjuntos de dados mesclados (Figura 6B).
      Observação : isso abrirá a tela de coleções de dados , mas somente os conjuntos de dados do trabalho multiplex selecionado serão mostrados.
   2. Clique na guia Processamento automático do experimento superior.
   3. Clique na guia Processamento multiplex que corresponde ao número correto de conjuntos de dados mesclados.
   4. Clique no botão Logs & Files para baixar o .mtz e os arquivos de log correspondentes (como na etapa 3.2.3.)
4. Para acessar os resultados da varredura de grade
   1. Navegue até a tela Coleções de dados para a visita desejada. Os resultados dos dados da varredura de grade serão exibidos ao lado de quaisquer dados de rotação coletados.
      Observação : não haverá resultados de processamento automático.
   2. A imagem da gota de cristal terá a grade sobreposta com um mapa de calor representando a presença de difração. Clique em um quadrado para visualizar a imagem de difração dessa posição na grade. Clique no menu suspenso na parte superior da imagem do poço de cristal para alterar o que o mapa de calor representa. O padrão é a intensidade total da difração, mas pode ser alterado para pontos totais, resolução estimada ou quadros sem gelo.

4. Reprocessamento de dados

Observação : conjuntos de dados selecionados podem ser reprocessados por meio da interface ISPyB¹¹ usando os mesmos pipelines de processamento que são executados automaticamente com configurações alteradas conforme definido pelo usuário. Um corte de resolução pode ser aplicado; Se a simetria/célula do cristal for conhecida, isso também pode ser definido para garantir que os pipelines de processamento funcionem na configuração correta. Intervalos de imagens selecionados em conjuntos de dados específicos também podem ser mesclados usando pipelines multicristal disponíveis. Isso pode ser vantajoso se danos sistemáticos por radiação fizerem com que a última porção das imagens de difração seja de baixa qualidade. Também é uma opção para o usuário baixar seus conjuntos de dados usando o protocolo descrito acima e executar seu software de reprocessamento desejado localmente, tutoriais para os quais estão disponíveis gratuitamente em outro lugar (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

1. Para reprocessar vários conjuntos de dados individuais
   1. Faça login no ISPyB e navegue até os conjuntos de dados de interesse (etapa 3.1).
   2. Clique em um conjunto de dados e clique no ícone de engrenagem na barra de título do conjunto de dados (Figura 6) para abrir a janela de reprocessamento.
   3. Defina as configurações desejadas e selecione quais quadros serão incluídos no reprocessamento.
      NOTA: O intervalo de imagens pode ser definido digitando um intervalo nas caixas rotuladas ou clicando e arrastando a região desejada no gráfico de análise por imagem (Figura 7A).
   4. OPCIONAL: Para adicionar outro conjunto de dados para reprocessamento individual, clique em seu ícone de engrenagem e ele aparecerá na janela de reprocessamento abaixo do primeiro conjunto de dados. Marque a caixa Processo Individualmente .
   5. Clique no botão Integrar .
2. Para reprocessar dados multicristal
   1. Abra a janela de reprocessamento de qualquer conjunto de dados.
   2. Clique no botão Multi-Crystal para abrir uma nova tela.
   3. Role para baixo para encontrar uma série de gráficos de análise por imagem de experimentos durante a visita.
   4. Escolha um pipeline de processamento no menu suspenso.
   5. OPCIONAL: Defina quaisquer limites de resolução ou parâmetros de célula de unidade conhecidos.
   6. Clique e arraste para definir os intervalos de imagens a serem incluídos no reprocessamento multicristal (Figura 7).
      Observação : isso deve ser feito em vários gráficos diferentes para que conjuntos de dados de vários cristais diferentes são mesclados.
   7. Clique no botão Integrar (Figura 7B).
3. Para acessar dados reprocessados
   1. Navegue até a página Coleções de Dados para a visita específica (etapas 3.1.1-3.1.3).
   2. Clique no botão Reprocessamento na parte superior da tela.
   3. Role para baixo para localizar o trabalho desejado.
   4. Clique no caminho do arquivo na coluna da direita para abrir a tela Coleções de dados para os dados reprocessados.
   5. Abra a guia Processamento automático e baixe os dados conforme descrito anteriormente (etapa 3.2).
      Observação : todos os trabalhos reprocessados são identificáveis pelo símbolo de setas circulares ao lado do nome do pipeline.

Discussion

Descrevemos todo o procedimento desde a chegada de uma amostra de proteína na FC até o download dos dados finais pelo usuário para outras aplicações. As etapas críticas são a produção de uma amostra de proteína de alta qualidade e telas de cristal apropriadas, seja usando telas de matriz esparsa comercial ou telas de otimização com base em condições estabelecidas. Este processo pode ocorrer na FC, ou os usuários podem realizar os procedimentos de cristalização nos laboratórios domésticos e trazer placas de cristalização adequadas para a linha de luz. A identificação de parâmetros adequados de coleta de dados pode ser importante para determinadas amostras, especialmente quando os danos causados pela radiação são uma preocupação. Na maioria dos casos, o processamento automatizado de dados é totalmente suficiente para responder à questão científica, embora os usuários mantenham a capacidade de reprocessar usando as ferramentas da linha de luz, por exemplo, quando o grupo espacial é ambíguo ou apenas a parte inicial dos dados coletados é usada para minimizar os efeitos de danos da radiação.

Se cristais adequados não forem produzidos a partir de ensaios iniciais de cristalização, mudanças na concentração de proteínas, pureza ou telas de cristalização podem ser exploradas, assim como o uso de semeadura de cristais. Se os cristais não difratarem para uma resolução útil na linha de luz, então varreduras em grade podem ser usadas com um feixe não atenuado para avaliar o limite de difração inerente e a célula unitária dos cristais para guiar os esforços de otimização. Cristais que são muito pequenos para coleta de dados dentro de placas (por exemplo, <10 μm) podem, em vez disso, ser adequados para cristalografia serial ou experimentos de nanofoco (por exemplo, na linha de luz Diamond VMXm). A resolução de estruturas usando dados VMXi é geralmente simples por substituição molecular, particularmente desde o advento do Alphafold¹⁶ para fornecer modelos de busca eficazes. Se isso não for bem-sucedido, os cristais podem ser colhidos e crioresfriados de placas para permitir experimentos convencionais de difração anômala de comprimento de onda único, difração anômala de comprimento de onda múltiplo ou experimentos de faseamento de comprimento de onda longo.

As vantagens deste método incluem a capacidade de obter conjuntos de dados rápidos e de alta qualidade e feedback diretamente de placas de cristalização sem a necessidade de perturbar os cristais dos ambientes em que cresceram. O chamado "Renascimento da temperatura ambiente" em biologia estrutural valoriza estruturas obtidas em condições não criogênicas para permitir que mais relevância fisiológica e dinâmica proteica sejam exploradas². Normalmente, uma resolução ligeiramente menor é alcançada do que para um cristal crioresfriado otimizado, mas somente quando condições adequadas de crio foram estabelecidas e se os cristais são robustos ao manuseio mecânico e abertura da gota de cristalização³. Uma próxima aplicação para a qual este pipeline é muito adequado é uma triagem em larga escala de complexos proteína-ligante ou campanhas de fragmentos à temperatura ambiente na descoberta de drogas. Os ligantes ou fragmentos podem ser cocristalizados ou adicionados por pipeta ou ejeção de gota acústica antes da coleta de dados à temperatura ambiente. Outra aplicação é medir rapidamente dados de muitas centenas ou milhares de cristais de maneira altamente eficiente e, em seguida, usar o software multiplex¹⁴ DIALS¹⁷ para extrair aglomerados isomórficos que podem representar diferentes entidades biológicas ou estabelecer diferenças estatisticamente significativas entre populações de cristais que foram tratados de maneira diferente ou expostos a diferentes ligantes ou sinais.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formulator	Formulatrix	on request	Liquid handling robot
Formulatrix imager	Formulatrix	on request	Crystallisation plate imager
Greiner CrystalQuick X	Greiner	Z617644	Crystallisation plate
Gryphon	Art Robbins Instruments	620-1000-10	Crystalisation robot
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	Crystallisation plate
Mosquito LCP	(SPT Labtech)	on request	Crystallisation robot
Rock Imager & Maker	Formualtrix	on request	Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion