Мы представляем протокол кристаллизации белков с использованием кристаллизационной установки в исследовательском комплексе в Харвелле и последующего сбора рентгеновских кристаллографических данных in situ с кристаллов внутри пластин на пучковой линии универсальной макромолекулярной кристаллографии in situ (VMXi) компании Diamond. Мы описываем требования к образцам, протоколы кристаллизации и рекомендации по сбору данных.
Описаны протоколы роботизированной кристаллизации белков с использованием кристаллизационной установки в Харвелле и сбора данных о комнатной температуре in situ с кристаллизационных пластин на пучковой линии Diamond Light Source VMXi. Такой подход позволяет легко определять высококачественные кристаллические структуры при комнатной температуре из нескольких кристаллов и обеспечивает очень быструю обратную связь по результатам кристаллизационных испытаний, а также позволяет проводить серийную кристаллографию. Значение структур при комнатной температуре для понимания структуры белка, связывания лигандов и динамики становится все более признанным в сообществе структурной биологии. Этот конвейер доступен пользователям со всего мира с несколькими доступными режимами доступа. Поставленные эксперименты по кристаллизации можно визуализировать и просматривать удаленно, а кристаллы автоматически идентифицируются с помощью инструмента машинного обучения. Данные измеряются в системе на основе очереди с наборами данных с углом поворота до 60° от выбранных пользователем кристаллов в пластине. Данные со всех кристаллов в определенной лунке или группе образцов автоматически объединяются с помощью xia2.multiplex, а доступ к выходам осуществляется через интерфейс веб-браузера.
Рентгеновская кристаллография остается ключевым инструментом для понимания структуры и функций белков, обеспечивая высокое разрешение структур белков или их комплексов, например, с субстратами или кандидатами в лекарственные препараты. Во многих случаях, однако, получение кристаллов с желательными свойствами - высокой дифракцией, кристаллической формой, поддающейся замачиванию, и без кристаллических патологий, таких как двойник, - остается значительным узким местом1. Поскольку подходящие химические условия для производства кристаллов белка, как правило, не могут быть предсказаны, стандартным является скрининг кристаллизации, изучающий тысячи потенциальных химических смесей, часто с помощью автоматизации/робототехники при настройке экранов и кристаллических отелей для мониторинга, часто удаленного, записанных изображений кристаллизационных капель.
Когда кристаллы появляются, как правило, их необходимо извлечь из среды кристаллизации с помощью нейлоновой или каптоновой петли, а затем перенести в каплю, содержащую криопротектор (поиск которого является дополнительной переменной), прежде чем погрузиться в замораживание в жидкий азот. Эти дополнительные этапы между кристаллизацией и сбором рентгеновских данных могут включать в себя обезвоживание кристаллизационной капли при разрушении ее герметичной среды, механические нагрузки на кристалл при обращении с ним и повреждение кристаллической решетки криопротекторами (обычно приводящее к увеличению распространения мозаики)среди других факторов 2. Кроме того, сбор кристаллов требует много времени и труда и может привести к неоднородности между образцами, особенно когда в процессе сбора образуется пленка на каплях. Лучевая линия VMXi обеспечивает доступ к полезным данным от кристаллов, прилипших к пластине, которые в противном случае были бы отброшены для сбора данных.
Подавляющее большинство рентгеновских кристаллических структур определяется при 100 К с использованием описанного выше подхода, что обеспечивает простой транспорт и обработку кристаллов и увеличивает время жизни кристаллов в рентгеновском пучке на порядки. Тем не менее, растет интерес к определению структур в некриогенных условиях, т.е. гораздо более близких к физиологическим условиям, относящимся к функции белка 2,3,4. Это позволяет гораздо лучше понять динамическую структуру белков, позволяет избежать замораживания аминокислотных конформаций или петель в функционально нерелевантных состояниях5 и позволяет исследовать связывание лигандов в условиях, гораздо более близких к тем, которые находятся в естественной среде белка в клетке и организме6.
Альтернативный подход, реализованный на пучковой линии универсальной макромолекулярной кристаллографии in situ (VMXi) на синхротроне Diamond Light Source, Великобритания, заключается в измерении дифракционных данных непосредственно от кристаллов в среде, в которой они выросли (т.е. внутри кристаллизационной пластины), в условиях окружающей среды и без возмущений 7,8. Это обеспечивает очень быструю обратную связь с кристаллизационными ситами и оптимизацию, чтобы помочь пользователю найти оптимальную форму кристалла в соответствии с его требованиями. Кроме того, он позволяет автоматически изготавливать высококачественные конструкции при комнатной температуре9.
Этот протокол предполагает, что у пользователя есть образец белка высокой чистоты, готовый к кристаллизации. Мы опишем пользовательский опыт доступа к кристаллизационной установке в Харвелле для производства белковых кристаллов и последующего использования пучка VMXi для сбора данных (рис. 1).
Кристаллизационный цех в Харуэлле
Кристаллизационная установка в Харуэлле (CF) расположена в исследовательском комплексе в Харуэлле (RCaH), рядом с алмазным источником света. Объект предлагает пользователям высокопроизводительную автоматизированную лабораторию для кристаллизации макромолекул, использующую робототехнику для скрининга кристаллизации, оптимизации кристаллов, визуализации кристаллов и их характеризации. Благодаря тесной интеграции с высокоавтоматизированной пучковой линией VMXi скорость определения структур при комнатной температуре значительно ускорилась и позволяет характеризовать новые белковые структуры, белок-лигандные и ДНК-лигандные комплексы, а также автоматизированный скрининг фрагментов (рис. 1) в некриогенных условиях.
Трубопровод CF представляет собой набор приборов, включающий в себя нанолитровых кристаллизационных роботов9 для кристаллизации растворимых и мембранных белков, роботов для работы с жидкостями для подготовки коммерческих кристаллизационных сит и сложных специализированных оптимизационных сит, а также четыре прибора для визуализации (один при 4 °C и три при 20 °C для визуализации кристаллизационных пластин (см. таблицу материалов). Один тепловизор способен визуализировать стеклянные пластины с липидной кубической фазой (LCP), а другой оснащен мультифлуоресцентной оптикой (оба при температуре 20 °C).
В настоящее время установка широко используется широким кругом академических и промышленных пользователей, включая Лабораторию мембранного белка (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), установка скрининга фрагментов XChem 10, пучковые линии MX, концентратор XFEL, а также Институт Розалинд Франклин (RFI). Этот хорошо зарекомендовавший себя и оптимизированный конвейер позволил проводить эксперименты по кристаллизации в широком спектре проектов в области структурной биологии. В этой статье описывается конвейер для кристаллов, предназначенных для сбора данных в VMXi, хотя кристаллы также могут быть собраны и подвергнуты криоохлаждению или направлены в конвейер XChem.
Доступ пользователей распределяется через систему предложений Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html), а промышленные пользователи поддерживаются через группу по связям с алмазной промышленностью. Все пользователи могут прийти на объект со своими образцами или планшетами, которые можно транспортировать вручную. Не рекомендуется отправлять пластины курьером, так как наш опыт показывает, что капли могут отойти от места, в котором они были выданы, или капли могут быть повреждены резервуаром для кристаллизации. Кроме того, по договоренности пользователи могут отправить свои образцы белка в CF, где сотрудники организуют эксперименты по кристаллизации от их имени. Эксперименты могут контролироваться удаленно пользователем, либо войдя в Rock Maker Web в случае CF, либо через ISPyB в случае VMXi. Доступ к CF может осуществляться итерационным способом на основе результатов рентгеновской дифракции, собранных в Diamond.
Beamline VMXi на алмазном источнике света
Beamline VMXi (далее именуемый «Beamline») — это уникальный и недавно разработанный прибор, полностью предназначенный для высокоавтоматизированной рентгеновской кристаллографии при комнатной температуре с акцентом на измерение данных из кристаллов в подходящих кристаллизационных пластинах. Линия пучка обеспечивает микрофокусный (10 x 10 мкм), розовый пучок (полоса пропускания <5 × 10-2ΔE/E) с высоким потоком ~2 × 1013 фотонов/с (при 16 КэВ)7. Этот высокопоточный пучок в сочетании с быстрым детектором обеспечивает очень высокую пропускную способность образцов и сбор данных с образцов размером более 10 мкм.
Кристаллизационные планшеты поступают в линию пучка, сохраняясь в системе хранения образцов и получая изображения по расписанию, предоставленному пользователем при регистрации планшетов с помощью интерфейса ISPyB11 SynchWeb12. Как правило, пользователям рекомендуется выбрать последовательность временных точек Фибоначчи для визуализации (0, 12, 24, 36, 60... 7 320 ч с момента ввода пластины в систему). Пользователь получает уведомление по электронной почте, как только пластина будет сфотографирована. Изображения как в видимом, так и в ультрафиолетовом свете доступны пользователям по запросу. Изображения, полученные системой хранения образцов, анализируются алгоритмом машинного обучения; Это автоматически находит и определяет точки интереса объектов, напоминающих кристаллы, и регистрирует точки интереса, готовые для добавления пользователя в очередь на сбор данных. Пользователи также могут вручную щелкнуть по изображениям в видимом свете, чтобы зарегистрировать точки интереса, или щелкнуть и перетащить область для анализа растровым сканированием. Эти точки доступны пользователям для добавления в очередь вместе с автоматически находящимися точками.
После того, как все образцы имеют соответствующие параметры для сбора данных, пластина попадает в очередь. Когда пластина достигает вершины очереди, она автоматически распределяется по линии пучка. Кристаллизационные пластины загружаются из кристаллических отелей в линию пучка автоматически с помощью роботизированной руки, и после сопоставления изображений для каждого выбранного кристалла измеряются наборы кристаллографических данных с углом поворота до 60° в соответствии с пользовательскими инструкциями. Все капли в пластине могут быть использованы для этих экспериментов на линии пучка. Данные объединяются из нескольких кристаллов для получения изоморфных, оптимально объединенных наборов данных автоматизированным способом 7,9. После того, как все наборы данных в очереди собраны, пользователю отправляется электронное письмо со ссылкой, по которой он может перейти для просмотра наборов данных в ISPyB11, как и в других пучковых линиях Diamond MX. Пользователи также перенаправляются на веб-страницу beamline (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).
1. Получение кристаллов в пластинах in situ с использованием кристаллизационной установки в Харвелле
ПРИМЕЧАНИЕ: Доступ к CF поддерживается несколькими различными способами и зависит от приложения проекта и типа пользователя (академический или отраслевой). Проекты XChem и MPL имеют свою собственную систему подачи заявок через систему администрирования пользователей (UAS) и могут быть представлены либо по стандартному маршруту доступа (включая iNEXT Discovery и EUbOPEN), либо через BAG Access. Приведенный ниже протокол предназначен для пользователей VMXi.
2. Использование линии луча на алмазном источнике света
ПРИМЕЧАНИЕ: Все взаимодействие с лучевой линией пользователями осуществляется удаленно с помощью интерфейса ISPyB11 . Физическое присутствие на линии пучка не требуется, а данные собираются с помощью системы на основе очередей, а не планируются в определенное время. У пользователей будет предложение, связанное с их доступом к Diamond Light Source. На линии пучка каждой кристаллизационной пластине присваивается уникальное посещение, и она определяется как «контейнер» в ISPyB11 по аналогии с шайбой, содержащей образцы при 100 К. Экраны оптимизации не могут быть созданы с помощью интерфейса SynchWeb, поэтому информация обычно добавляется в раздел комментариев (см. шаг 2.1.4.). Лицо, регистрирующее номерной знак, должно будет проверить адрес электронной почты, так как владелец таблички будет получать электронные письма, касающиеся изображений, а также уведомления о заполненных номерных знаках.
3. Доступ к автоматической обработке данных
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как данные собраны, они проходят через несколько конвейеров автоматической обработки данных. Четыре стандартных конвейера, используемых по пучковым линиям MX в Diamond, также работают на данных, собранных на пучковой линии. Это 'fast_dp', 'xia2 dials', 'xia2 3dii' и 'autoPROC'15. «fast_dp» обеспечит быстрое сокращение данных для быстрой оценки качества. Остальные три конвейера потребуют больше времени вычислений и будут запускать множество различных программных пакетов для сокращения объема данных для сравнения. Соответственно, выход обычно более высокого качества, чем выход 'fast_dp'. Наборы данных, собранные на линии пучка, также будут проходить через программное обеспечение для автоматического слияния мультикристаллов xia2.multiplex'14, которое объединит все наборы данных в определенную группу. Обратите внимание, что, хотя сканирование сетки в настоящее время не обрабатывается автоматически, данные можно обработать вручную с помощью конвейера xia2.ssx. Результаты конвейеров автоматической обработки можно найти в ISPyB11 по следующему протоколу.
4. Повторная обработка данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранные наборы данных могут быть повторно обработаны через интерфейс ISPyB11 с использованием тех же конвейеров обработки, которые запускаются автоматически с измененными настройками, определенными пользователем. Может быть применена отсечка разрешения; Если известна симметрия/ячейка кристалла, то ее также можно определить, чтобы гарантировать, что конвейеры обработки работают в правильных настройках. Выбранные диапазоны изображений в определенных наборах данных также можно объединить с помощью доступных мультикристаллических конвейеров. Это может оказаться полезным, если систематическое радиационное повреждение приводит к тому, что последняя часть дифракционных изображений имеет низкое качество. Кроме того, пользователь может загрузить свои наборы данных, используя протокол, описанный выше, и запустить желаемое программное обеспечение для обработки данных локально, учебные пособия по которому находятся в свободном доступе в другом месте (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).
Кристаллизационная установка и пучковая линия VMXi используются в самых разных проектах и сценариях использования. Вот небольшое количество примеров, чтобы проиллюстрировать, что пользователи могут захотеть сделать.
Пример 1: Стандартный сбор данных
Линия пучка позволяет быстро определять кристаллические структуры при комнатной температуре из небольшого количества кристаллов внутри кристаллизационной пластины. Минимальное количество кристаллов зависит от пространственной группы и ориентации кристаллов, но часто составляет от 1 до 4, хотя улучшение качества данных может быть достигнуто путем слияния данных из нескольких десятков кристаллов. Недавний пример — один из стандартов пучковой линии — тауматин. Несколько кристаллов, показанных на рисунке 8А, были размечены для сбора данных вручную, как описано в разделе протокола 2.3. Эти кристаллы были добавлены в очередь, как описано в разделе протокола 2.4, и экспериментальные параметры были выбраны из выпадающего списка. После того, как экспериментальные параметры были применены, пластина была поставлена в очередь для сбора данных. Наборы данных собирались, автоматически масштабировались и объединялись с помощью конвейера xia2.multiplex, как описано в разделе 3 протокола. Пример выходных данных SynchWeb показан на рисунке 8A . В результате слияния пяти наборов данных получился набор данных с разрешением 1,66 Å. Для стандартного сбора данных примерно из пяти кристаллов в скважине наборы данных собирались в течение 2,5 минут.
Кейс 2: Связывание лигандов – эксперимент с фрагментами с использованием белка Mac1
Получение структур белково-лигандных комплексов при комнатной температуре может быть непосредственно достигнуто с помощью пучковой линии. Лиганды могут быть добавлены в капли на кристаллизационных планшетах (вручную или путем акустической капельной инъекции), а данные измерены после соответствующего инкубационного времени. В описанном здесь примере серия фрагментов была диспенсирована в лунки, содержащие кристаллы первого макродомена SARS-CoV-2 белка nsp3 (Mac-1) в кристаллизационной пластине. Две скважины, содержащие один и тот же фрагмент, были отнесены к группе, как описано в шаге 2.5 протокола. Несколько кристаллов (42) были помечены для сбора данных, как описано в шагах протокола 2.3 и 2.4, а наборы данных были собраны с использованием стандартных параметров (поворот на 60°, шаг 0,1°, экспозиция 0,00178 с, пропускание 5%, 16 КэВ - на кристалл) (рис. 8B). Наборы данных из двух скважин были автоматически обработаны с помощью конвейера xia2.dials, а затем был инициирован конвейер xia2.multiplex для автоматического слияния 22 из этих наборов данных. Затем DIMPLE был запущен на выходе этих конвейеров и получил карты, на которых четко видны доказательства связанного фрагмента. Фрагментная модель была встроена в незанятую плотность и дополнительно уточнена (рис. 8B , справа). Структуры, связанные с лигандами комнатной температуры, могут быть легко определены с помощью этой серии шагов, чтобы предоставить бесценную информацию и обратную связь для процесса разработки лекарств на основе структуры. Для сбора данных из 42 кристаллов в нескольких скважинах наборы данных были собраны в течение 10 минут.
Пример 3: Структурное решение с группой пространств с низкой симметрией и предпочтительными ориентациями Стек из нескольких кристаллов с пластинчатой морфологией был получен в экспериментах по кристаллизации с газосвязывающим цитохромом с-типа (рис. 8C). Выбрав несколько позиций по краю стека, где в рентгеновском пучке находился только один кристалл, можно было получить набор данных хорошего качества с разрешением 1,75 Å путем слияния клиньев из четырех кристаллов, несмотря на моноклинную (C2) пространственную группу. Это позволило быстро продвинуться вперед без необходимости дальнейшей оптимизации условий кристаллизации. Этот результат был описан ранее9. Для сбора данных из четырех кристаллов в скважине наборы данных были собраны в течение 2 минут.
Кейс 4: Получение информации и структуры при комнатной температуре микрокристаллов в планшете с помощью серийной кристаллографии
Часто, когда микрокристаллы появляются в каплях или когда пользователи стремятся оптимизировать протоколы микрокристаллизации в качестве предшественника серийных кристаллографических экспериментов на синхротронных источниках или источниках XFEL, очень полезно получить быструю обратную связь о дифракционных свойствах и размерах элементарных ячеек в различных испытаниях с использованием минимального материала. В этом случае микрокристаллы лизоцима, растущие партиями, пипетировали в кристаллизационную пластину (объем 200 нл на каплю) и собирали данные из восьми капель с помощью сетчатого сканирования с шагом 10 мкм (рис. 9). Полученные 25 906 неподвижных изображений были обработаны с помощью программного обеспечения для серийной кристаллографии, в результате чего был получен набор данных, в котором 9 891 дифракционная картина была проиндексирована и объединена, в результате чего был получен набор данных с разрешением 2,0 Å, который хорошо уточнялся в соответствии с опубликованной структурой комнатной температуры (работа R = 19,6%,свободная работа R = 23,6% при использовании PDB 8A9D) (Таблица 1). Это позволило провести детальный анализ распределения элементарных ячеек и определить структуру микрокристаллической комнатной температуры, что может быть использовано в сложных экспериментах по серийной кристаллографии, включая исследования с временным разрешением. Общий объем необходимой микрокристаллической суспензии составлял 1,6 мкл. Для сбора данных о микрокристаллах в восьми скважинах с использованием сканирования сетки наборы данных были собраны в течение 40 минут.
Рисунок 1: Схема трубопровода «белок-структура», включающего скрининг кристаллизации, оптимизацию на кристаллизационной установке, автоматизированный сбор и обработку данных при комнатной температуре без отбора образцов на VMXi, скрининг фрагментов XChem и сбор данных на других пучковых линиях MX. Пользователи могут запустить трубопровод, подав образец или поднеся пластины к линии пучка VMXi. Аббревиатура: Универсальная макромолекулярная кристаллография in situ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Интерфейс Mosquito SPT Labtech для настройки кристаллизационных планшетов. (A) (1) Вид установки MiTeGen In Situ-1. Выберите стандартную пластину MiTeGen 2 , перейдя к (2) типу 96-луночного планшета и выбрав (3) пластину MiTeGen 2. Чтобы изменить параметры определения для дропов 1 и 2, которые необходимы для VMXi, нажмите на значок редактирования (4). Откроется новое окно (B), в котором (5) смещения X и Y должны быть изменены, как показано на рисунке. Выберите (B) вспомогательный колодец 2 и (C) вспомогательный колодец 3 и измените значения соответствующим образом. (D) Вид настройки CrystalQuickX . Выберите стандартную пластину CrystalQuickX 2 , перейдя к типу 96-луночного планшета и выбрав пластину MiTeGen plate 2. Чтобы изменить параметры определения для дропа 1 и сброса 2, что требуется для VMXi, нажмите на значок редактирования так же, как и выше. Откроется новое окно, в котором (E,F) смещения X и Y должны быть изменены, как показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Интерфейс SynchWeb, показывающий, как создать отправление VMXi, зарегистрировать табличку и проверить контактные данные. Скриншоты различных этапов загрузки информации в интерфейс SynchWeb отображаются из (A) выпадающего меню, (B,C) регистрация нового отправления, (D) регистрация нового контейнера, (E) ввод информации о номерном знаке, (F) проверка контактных данных и (G) список зарегистрированных контейнеров в предложении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Выбор и подготовка образцов для сбора данных с помощью SynchWeb. Показана серия снимков экрана, показывающих различные этапы подготовки образцов к сбору данных с помощью интерфейса SynchWeb. (A) Точки и области интереса выбираются из обзора перетаскивания. В нижней части этого панно находится хронологическая серия фотографий одной капли. (B) Пример вывода CHiMP для одной пластины с выделением результатов для категории «кристалл». (C) Добавление образцов в очередь из списка выбранных точек и областей и (D) применение параметров для сбора данных к поставленным в очередь образцам из выпадающего списка настроек эксперимента, созданного с помощью линии пучка. Обратите внимание на разницу между образцами без экспериментальных параметров (выделены красным цветом) и образцами с правильно примененными параметрами (вверху и внизу). В нижней части этой панели находится кнопка Контейнер очереди , которая ставит в очередь пластину, которую нужно собрать на лучевой линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Пример создания группы в SynchWeb. Серия снимков экрана, показывающих различные этапы создания групп выборки. (A) Из соответствующей партии выбираются пластины, содержащие образцы, и (B) отбираются капли внутри пластины. Это могут быть отдельные дропы или могут быть выбраны по строкам и/или столбцам. (C) Список уже созданных групп выборки. (D) Выходные данные последних трех заданий мультиплексной обработки перечислены и могут быть выбраны для отображения статистики из конвейера обработки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Обработка и сокращение данных. (A) Снимок экрана обработанного набора данных в ISPyB11. Кнопка для доступа к функциям повторной обработки выделена. Идентификатор образца и параметры эксперимента показаны в левом верхнем углу, а средство просмотра дифракционных изображений — посередине. При нажатии на это изображение откроется интерактивное окно для изучения различных изображений. Справа показана программа просмотра изображений кристаллов, при нажатии на которую также откроется интерактивное окно для сравнения изображений линии пучка и хранилища Formulatrix. График анализа каждого изображения показан справа, и при нажатии на это изображение откроется увеличенная версия этого вывода. Щелчок на вкладке «Автоматическая обработка » сделает автообработку видимой и упростит сравнение результатов различных конвейеров. Нажимайте на вкладки, чтобы переключаться между различными конвейерами обработки и просматривать подробные выходные данные выбранного конвейера. Кнопка Logs & Files для загрузки данных выделена. Щелкнув вкладку Downstream Processing , вы развернете и получите результаты для всех наборов данных, пропущенных через конвейеры сокращения после обработки данных, где это необходимо. (B) Снимок экрана Управление группой образцов . Пользовательское название группы находится вверху, а визуальное описание включенных скважин можно увидеть ниже. Зеленая лунка указывает на то, что все кристаллы, измеренные из этой капли, будут включены в группу. Можно увидеть сводку различных заданий мультиплексирования, выполненных в этой группе, а под ней — подробные выходные данные мультиплексирования. Кнопка Наборы данных для просмотра включенных экспериментов будет выделена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Окна повторной обработки данных. (А) Индивидуальные и (Б) мультикристаллические наборы данных. Отображаются два отдельных набора данных, в которых были выбраны области данных. Если установлен флажок Обрабатывать по отдельности , выбранные дифракционные изображения будут обработаны по отдельности нажатием кнопки Интегрировать . При нажатии на кнопку Мультикристалл откроется отображение отдельных наборов данных. Для повторной обработки дифракционных изображений из нескольких наборов данных области изображений выбираются как отображаемая, и повторная обработка инициируется нажатием кнопки Интегрировать, как выделено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Репрезентативные результаты конвейера VMXi. (A) Размеченные кристаллы для белка тауматина в кристаллизационной капле (левая панель), результаты обработки данных (центральная панель) и электронная плотность (правая панель). (B) Сбор на нескольких кристаллах для определения связывания фрагмента с макродоменом SARS-CoV-2. Датасеты собирались на нескольких кристаллах в присутствии фрагмента с экрана фрагментов EU-OPENSCREEN с использованием стандартных экспериментальных настроек. Примеры таких наборов данных показаны в этом отрывке из SynchWeb. Фрагмент был встроен в соответствующую плотность и дополнительно доработан, как показано в крайнем справа. (C) Размеченные моноклинные кристаллы в стеке из сложного кристаллизационного удара, используемого для сбора данных. Зеленые крестики и красные цифры показывают, где данные были измерены с помощью луча 10 мкм и поворота на 60°. Четыре из получившихся сегментов были объединены для получения набора данных с разрешением 1,75 Å. Плотность электронов вокруг гемовой группы показана справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Серийная кристаллография в кристаллизационной пластине. (A) Оптическое изображение кристаллизационной капли с белой рамкой, представляющей интересующую область. (B) Определение точек сканирования сетки. (C) Тепловая карта, показывающая дифракцию. (D) Карта электронной плотности, полученная на основе набора данных последовательной кристаллографии из более чем 9 000 неподвижных дифракционных картин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Разрешение (Å) | Полнота (%) | Многочисленность | Я/σ(Я) | Разделение R | КК1/2 | Уникальные наблюдения |
Полный | 100 | 95.5 | 20.8 | 0.063 | 0.998 | 8422 |
Низкий (55.55 - 5.43) | 100 | 147.1 | 81.7 | 0.028 | 0.999 | 488 |
Высокий (2.03 -2.00) | 100 | 75.3 | 1.2 | 1.092 | 0.410 | 411 |
Таблица 1: Статистика данных для набора последовательных данных VMXi RT. Сокращения: I = средняя интенсивность масштабированных наблюдений; R split = мера расхождения измеренных интенсивностей; CC 1/2 = коэффициент корреляции между двумя случайными половинами набора данных.
Мы описали полную процедуру от поступления образца белка в КФ до загрузки окончательных данных пользователем для дальнейшего применения. Важнейшими этапами являются получение высококачественного образца белка и соответствующих кристаллических сит с использованием либо коммерческих сит с разреженной матрицей, либо с использованием оптимизационных сит на основе установленных условий. Этот процесс может происходить в КФ, или пользователи могут выполнять процедуры кристаллизации в домашних лабораториях и подносить подходящие кристаллизационные пластины к линии пучка. Идентификация подходящих параметров сбора данных может быть важна для определенных образцов, особенно там, где есть радиационное повреждение. В большинстве случаев для ответа на научный вопрос вполне достаточно автоматизированной обработки данных, хотя пользователи сохраняют возможность повторной обработки с помощью инструментов лучевой линии, например, в тех случаях, когда пространственная группа неоднозначна или используется только начальная часть собранных данных для минимизации последствий радиационного повреждения.
Если подходящие кристаллы не получены в результате первоначальных кристаллизационных испытаний, то могут быть изучены изменения концентрации, чистоты белка или кристаллизационные сита, а также использование кристаллического затравки. Если кристаллы не дифрагируют до полезного разрешения на линии пучка, то можно использовать сканирование сетки с незатухающим пучком для оценки собственного дифракционного предела и элементарной ячейки кристаллов, чтобы направлять усилия по оптимизации. Кристаллы, которые слишком малы для сбора данных в планшетах (например, <10 мкм), могут быть пригодны для серийной кристаллографии или нанофокусных экспериментов (например, на алмазной линии VMXm). Решение структур с использованием данных VMXi, как правило, является простым путем молекулярной замены, особенно после появления Alphafold16 для создания эффективных моделей поиска. Если это не удастся, кристаллы могут быть собраны и криохлаждены с пластин для проведения обычных экспериментов с одноволновой аномальной дифракцией, многоволновой аномальной дифракцией или длинноволновой фазировкой.
К преимуществам этого метода можно отнести возможность получения быстрых, высококачественных наборов данных и обратной связи непосредственно с кристаллизационных пластин без необходимости возмущать кристаллы из среды, в которой они росли. Так называемый «ренессанс комнатной температуры» в структурной биологии делает акцент на структурах, полученных в некриогенных условиях, чтобы позволить исследовать более физиологическую значимость и динамику белков. Обычно достигается несколько более низкое разрешение, чем для оптимизированного криоохлаждаемого кристалла, но только в том случае, если установлены подходящие криоусловия и если кристаллы устойчивы к механическому обращению и открытию кристаллизационной капли3. Предстоящее применение, для которого этот конвейер очень хорошо подходит, — это крупномасштабный скрининг белково-лигандных комплексов или кампаний фрагментов при комнатной температуре при разработке лекарств. Лиганды или фрагменты могут быть либо сокристаллизованы, либо добавлены пипеткой или акустическим выбросом капли перед сбором данных при комнатной температуре. Другое применение заключается в быстром измерении данных со многих сотен или тысяч кристаллов высокоэффективным способом, а затем использовании программного обеспечения DIALS17 multiplex14 для извлечения изоморфных кластеров, которые могут представлять различные биологические объекты, или для установления статистически значимых различий между популяциями кристаллов, которые были обработаны по-разному или подверглись воздействию различных лигандов или сигналов.
Мы выражаем признательность многим ученым и членам команды поддержки Diamond Light Source, которые внесли свой вклад в проектирование, строительство и эксплуатацию пучковой линии VMXi. Мы благодарны пользователям Beamline, которые впоследствии внесли свой вклад в разработку конвейеров кристаллизации и сбора данных. Кристаллизационный центр в Харуэлле поддерживается компанией Diamond Light Source Ltd, Институтом Розалинд Франклин и Советом по медицинским исследованиям.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Formulator | Formulatrix | on request | Liquid handling robot |
Formulatrix imager | Formulatrix | on request | Crystallisation plate imager |
Greiner CrystalQuick X | Greiner | Z617644 | Crystallisation plate |
Gryphon | Art Robbins Instruments | 620-1000-10 | Crystalisation robot |
MiTeGen Insitu-1 | Mitegen | InSitu-01CL-40 | Crystallisation plate |
Mosquito LCP | (SPT Labtech) | on request | Crystallisation robot |
Rock Imager & Maker | Formualtrix | on request |
Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/ |
Scorpion | Art Robbins Instruments | 640-1000-10 |
Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved