Сбор данных о кристаллизации и комнатной температуре in situ с использованием кристаллизационной установки Harwell и Beamline VMXi, алмазного источника света

Summary

Мы представляем протокол кристаллизации белков с использованием кристаллизационной установки в исследовательском комплексе в Харвелле и последующего сбора рентгеновских кристаллографических данных in situ с кристаллов внутри пластин на пучковой линии универсальной макромолекулярной кристаллографии in situ (VMXi) компании Diamond. Мы описываем требования к образцам, протоколы кристаллизации и рекомендации по сбору данных.

Abstract

Описаны протоколы роботизированной кристаллизации белков с использованием кристаллизационной установки в Харвелле и сбора данных о комнатной температуре in situ с кристаллизационных пластин на пучковой линии Diamond Light Source VMXi. Такой подход позволяет легко определять высококачественные кристаллические структуры при комнатной температуре из нескольких кристаллов и обеспечивает очень быструю обратную связь по результатам кристаллизационных испытаний, а также позволяет проводить серийную кристаллографию. Значение структур при комнатной температуре для понимания структуры белка, связывания лигандов и динамики становится все более признанным в сообществе структурной биологии. Этот конвейер доступен пользователям со всего мира с несколькими доступными режимами доступа. Поставленные эксперименты по кристаллизации можно визуализировать и просматривать удаленно, а кристаллы автоматически идентифицируются с помощью инструмента машинного обучения. Данные измеряются в системе на основе очереди с наборами данных с углом поворота до 60° от выбранных пользователем кристаллов в пластине. Данные со всех кристаллов в определенной лунке или группе образцов автоматически объединяются с помощью xia2.multiplex, а доступ к выходам осуществляется через интерфейс веб-браузера.

Introduction

Рентгеновская кристаллография остается ключевым инструментом для понимания структуры и функций белков, обеспечивая высокое разрешение структур белков или их комплексов, например, с субстратами или кандидатами в лекарственные препараты. Во многих случаях, однако, получение кристаллов с желательными свойствами - высокой дифракцией, кристаллической формой, поддающейся замачиванию, и без кристаллических патологий, таких как двойник, - остается значительным узким местом¹. Поскольку подходящие химические условия для производства кристаллов белка, как правило, не могут быть предсказаны, стандартным является скрининг кристаллизации, изучающий тысячи потенциальных химических смесей, часто с помощью автоматизации/робототехники при настройке экранов и кристаллических отелей для мониторинга, часто удаленного, записанных изображений кристаллизационных капель.

Когда кристаллы появляются, как правило, их необходимо извлечь из среды кристаллизации с помощью нейлоновой или каптоновой петли, а затем перенести в каплю, содержащую криопротектор (поиск которого является дополнительной переменной), прежде чем погрузиться в замораживание в жидкий азот. Эти дополнительные этапы между кристаллизацией и сбором рентгеновских данных могут включать в себя обезвоживание кристаллизационной капли при разрушении ее герметичной среды, механические нагрузки на кристалл при обращении с ним и повреждение кристаллической решетки криопротекторами (обычно приводящее к увеличению распространения мозаики)^среди других факторов 2. Кроме того, сбор кристаллов требует много времени и труда и может привести к неоднородности между образцами, особенно когда в процессе сбора образуется пленка на каплях. Лучевая линия VMXi обеспечивает доступ к полезным данным от кристаллов, прилипших к пластине, которые в противном случае были бы отброшены для сбора данных.

Подавляющее большинство рентгеновских кристаллических структур определяется при 100 К с использованием описанного выше подхода, что обеспечивает простой транспорт и обработку кристаллов и увеличивает время жизни кристаллов в рентгеновском пучке на порядки. Тем не менее, растет интерес к определению структур в некриогенных условиях, т.е. гораздо более близких к физиологическим условиям, относящимся к функции белка ^2,3,4. Это позволяет гораздо лучше понять динамическую структуру белков, позволяет избежать замораживания аминокислотных конформаций или петель в функционально нерелевантных состояниях⁵ и позволяет исследовать связывание лигандов в условиях, гораздо более близких к тем, которые находятся в естественной среде белка в клетке и организме⁶.

Альтернативный подход, реализованный на пучковой линии универсальной макромолекулярной кристаллографии in situ (VMXi) на синхротроне Diamond Light Source, Великобритания, заключается в измерении дифракционных данных непосредственно от кристаллов в среде, в которой они выросли (т.е. внутри кристаллизационной пластины), в условиях окружающей среды и без возмущений ^7,8. Это обеспечивает очень быструю обратную связь с кристаллизационными ситами и оптимизацию, чтобы помочь пользователю найти оптимальную форму кристалла в соответствии с его требованиями. Кроме того, он позволяет автоматически изготавливать высококачественные конструкции при комнатной температуре⁹.

Этот протокол предполагает, что у пользователя есть образец белка высокой чистоты, готовый к кристаллизации. Мы опишем пользовательский опыт доступа к кристаллизационной установке в Харвелле для производства белковых кристаллов и последующего использования пучка VMXi для сбора данных (рис. 1).

Кристаллизационный цех в Харуэлле

Кристаллизационная установка в Харуэлле (CF) расположена в исследовательском комплексе в Харуэлле (RCaH), рядом с алмазным источником света. Объект предлагает пользователям высокопроизводительную автоматизированную лабораторию для кристаллизации макромолекул, использующую робототехнику для скрининга кристаллизации, оптимизации кристаллов, визуализации кристаллов и их характеризации. Благодаря тесной интеграции с высокоавтоматизированной пучковой линией VMXi скорость определения структур при комнатной температуре значительно ускорилась и позволяет характеризовать новые белковые структуры, белок-лигандные и ДНК-лигандные комплексы, а также автоматизированный скрининг фрагментов (рис. 1) в некриогенных условиях.

Трубопровод CF представляет собой набор приборов, включающий в себя нанолитровых кристаллизационных роботов⁹ для кристаллизации растворимых и мембранных белков, роботов для работы с жидкостями для подготовки коммерческих кристаллизационных сит и сложных специализированных оптимизационных сит, а также четыре прибора для визуализации (один при 4 °C и три при 20 °C для визуализации кристаллизационных пластин (см. таблицу материалов). Один тепловизор способен визуализировать стеклянные пластины с липидной кубической фазой (LCP), а другой оснащен мультифлуоресцентной оптикой (оба при температуре 20 °C).

В настоящее время установка широко используется широким кругом академических и промышленных пользователей, включая Лабораторию мембранного белка (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), установка ^{скрининга фрагментов XChem 10}, пучковые линии MX, концентратор XFEL, а также Институт Розалинд Франклин (RFI). Этот хорошо зарекомендовавший себя и оптимизированный конвейер позволил проводить эксперименты по кристаллизации в широком спектре проектов в области структурной биологии. В этой статье описывается конвейер для кристаллов, предназначенных для сбора данных в VMXi, хотя кристаллы также могут быть собраны и подвергнуты криоохлаждению или направлены в конвейер XChem.

Доступ пользователей распределяется через систему предложений Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html), а промышленные пользователи поддерживаются через группу по связям с алмазной промышленностью. Все пользователи могут прийти на объект со своими образцами или планшетами, которые можно транспортировать вручную. Не рекомендуется отправлять пластины курьером, так как наш опыт показывает, что капли могут отойти от места, в котором они были выданы, или капли могут быть повреждены резервуаром для кристаллизации. Кроме того, по договоренности пользователи могут отправить свои образцы белка в CF, где сотрудники организуют эксперименты по кристаллизации от их имени. Эксперименты могут контролироваться удаленно пользователем, либо войдя в Rock Maker Web в случае CF, либо через ISPyB в случае VMXi. Доступ к CF может осуществляться итерационным способом на основе результатов рентгеновской дифракции, собранных в Diamond.

Beamline VMXi на алмазном источнике света

Beamline VMXi (далее именуемый «Beamline») — это уникальный и недавно разработанный прибор, полностью предназначенный для высокоавтоматизированной рентгеновской кристаллографии при комнатной температуре с акцентом на измерение данных из кристаллов в подходящих кристаллизационных пластинах. Линия пучка обеспечивает микрофокусный (10 x 10 мкм), розовый пучок (полоса пропускания <5 × ^10-2ΔE/E) с высоким потоком ~2 × 10¹³ фотонов/с (при 16 КэВ)⁷. Этот высокопоточный пучок в сочетании с быстрым детектором обеспечивает очень высокую пропускную способность образцов и сбор данных с образцов размером более 10 мкм.

Кристаллизационные планшеты поступают в линию пучка, сохраняясь в системе хранения образцов и получая изображения по расписанию, предоставленному пользователем при регистрации планшетов с помощью интерфейса ISPyB¹¹ SynchWeb¹². Как правило, пользователям рекомендуется выбрать последовательность временных точек Фибоначчи для визуализации (0, 12, 24, 36, 60... 7 320 ч с момента ввода пластины в систему). Пользователь получает уведомление по электронной почте, как только пластина будет сфотографирована. Изображения как в видимом, так и в ультрафиолетовом свете доступны пользователям по запросу. Изображения, полученные системой хранения образцов, анализируются алгоритмом машинного обучения; Это автоматически находит и определяет точки интереса объектов, напоминающих кристаллы, и регистрирует точки интереса, готовые для добавления пользователя в очередь на сбор данных. Пользователи также могут вручную щелкнуть по изображениям в видимом свете, чтобы зарегистрировать точки интереса, или щелкнуть и перетащить область для анализа растровым сканированием. Эти точки доступны пользователям для добавления в очередь вместе с автоматически находящимися точками.

После того, как все образцы имеют соответствующие параметры для сбора данных, пластина попадает в очередь. Когда пластина достигает вершины очереди, она автоматически распределяется по линии пучка. Кристаллизационные пластины загружаются из кристаллических отелей в линию пучка автоматически с помощью роботизированной руки, и после сопоставления изображений для каждого выбранного кристалла измеряются наборы кристаллографических данных с углом поворота до 60° в соответствии с пользовательскими инструкциями. Все капли в пластине могут быть использованы для этих экспериментов на линии пучка. Данные объединяются из нескольких кристаллов для получения изоморфных, оптимально объединенных наборов данных автоматизированным способом ^7,9. После того, как все наборы данных в очереди собраны, пользователю отправляется электронное письмо со ссылкой, по которой он может перейти для просмотра наборов данных в ISPyB¹¹, как и в других пучковых линиях Diamond MX. Пользователи также перенаправляются на веб-страницу beamline (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

Protocol

1. Получение кристаллов в пластинах in situ с использованием кристаллизационной установки в Харвелле

ПРИМЕЧАНИЕ: Доступ к CF поддерживается несколькими различными способами и зависит от приложения проекта и типа пользователя (академический или отраслевой). Проекты XChem и MPL имеют свою собственную систему подачи заявок через систему администрирования пользователей (UAS) и могут быть представлены либо по стандартному маршруту доступа (включая iNEXT Discovery и EUbOPEN), либо через BAG Access. Приведенный ниже протокол предназначен для пользователей VMXi.

1. Подача предложения и подготовка к визиту
   1. Предоставьте информацию о проекте в заявку на предложение BAG или добавьте ее в активное предложение BAG. Обычно есть координатор BAG, который организует оформление документов. В качестве альтернативы можно подать заявку на быстрый доступ к линии луча.
   2. Удостоверьтесь, что образец был зарегистрирован и проверен на безопасность в БАС по предложению до прибытия на место курьером или лично.
   3. Убедитесь, что пользователь зарегистрирован (с FedID и паролем).
   4. Убедитесь, что пользователь был добавлен в предложение MX в качестве партнера в UAS координатором BAG.
   5. Заполните форму сведений об образце кристаллизации пучка и отправьте форму VMXi@diamond.ac.uk.
   6. Поговорите с персоналом, работающим на линии пучка, о требованиях к эксперименту и доступности линии пучка.
   7. Если образцы белка отправляются, отправляйте образцы только по предварительной договоренности. За подробностями обратитесь к разделу 1.2.
   8. Если пользователь должен приехать на площадку для установки кристаллизационных планшетов в КФ, уточните у персонала установки наличие временного интервала для использования контрольно-измерительных приборов установки и следуйте разделу 1.2.1.
   9. Если пользователь приносит планшеты на площадку, убедитесь, что образец дозируется в планшет правильного типа, и поместите кристаллизационные капли в правильное место и в правильном количестве. Следуйте разделу 1.2.2. Линия пучка принимает только специфические кристаллизационные пластины in situ (Greiner CrystalQuickX и MiTeGen In Situ-1); следите за тем, чтобы капли не превышали 200 нл.
2. Кристаллизационный эксперимент, проведенный в КФ
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установка предлагает ряд высокопроизводительных методов кристаллизации макромолекул, таких как диффузия в паровой фазе, а также периодическая кристаллизация под нефтью и LCP. Рекомендуется начинать с 70-100 мкл чистого белка и проводить эксперименты по диффузии паров для растворимых белков с тремя ситами в соотношении 100 нл белкового раствора и 100 нл кристаллизационного резервуарного раствора и инкубировать планшеты при 20 °С. На объекте имеется несколько коммерческих экранов. Контроль влажности и температуры доступен с наиболее часто используемыми температурами 4 °C и 20 °C. Пользователи, посещающие CF, проходят стандартизированное обучение и получают поддержку по работе с инструментами кристаллизации и будут использовать настройки, описанные в настоящем документе.
   1. Отгрузка образцов для установки на КФ
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед прибытием на объект образец белка должен быть проверен в соответствии с предложением в системе UAS. После того, как образец белка прибудет на место, сотрудники организуют эксперименты по кристаллизации в соответствии с инструкциями, содержащимися в предыдущих сообщениях с пользователем. Подтверждение будет отправлено по электронной почте со штрих-кодом информации для экспериментальных кристаллизационных пластин. Пользователю будет предложено добавить кристаллизационные пластины в качестве контейнеров к соответствующему предложению. После этого пластины можно хранить в автоматизированных тепловизорах в кристаллизационной установке или на линии пучка. ISPyB будет интерфейсом, используемым для взаимодействия на линии пучка.
      1. Предоставить раствор образца белка в концентрации для кристаллизации в аликвотах, кратных 25 мкл. Четко обозначьте пробирки с образцом белка.
      2. При необходимости обеспечьте белковый буферный раствор, раствор лиганда или резервуарный раствор.
      3. Проинформируйте персонал учреждения о том, какие сита и коэффициенты падения следует использовать.
   2. Настройки кристаллизационной пластины
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы требуем, чтобы кристаллизационные капли в планшетах Greiner CrystalQuickX и MiTeGen In Situ-1 находились в определенном месте; тарелки, установленные в другом месте, должны использовать следующие настройки Mosquito¹³ , описанные здесь.
      1. Чтобы настроить определение пластины для MiTeGen In Situ-1, откройте программное обеспечение Mosquito SPT и перейдите на стандартную страницу определения пластины MiTeGen In Situ-1, нажав кнопку Setup | 96 Well | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 капли) (Рисунок 2A). Нажмите кнопку редактирования и измените значения для местоположения вспомогательной скважины 2: смещение по оси X на - 1,2 и смещение по оси Y на 1,8, а для местоположения вспомогательной скважины 3: смещение по оси X на 1,3 и смещение по оси Y на 1,8 (Рисунок 2B,C).
      2. Чтобы настроить определение пластины для Greiner CrystalQuickX, откройте программное обеспечение Mosquito SPT и перейдите на стандартную страницу определения пластины Greiner CrystalQuickX, щелкнув Setup | 96 Well | Greiner CrystalQuickX (Рисунок 2D). Нажмите кнопку редактирования и измените значения для местоположения вспомогательной скважины 1: смещение по оси X на - 1,95 и смещение по оси Y на 1,45 , а также для местоположения вспомогательной скважины 2: смещение по оси X на 1,95 и смещение по оси Y на 1,45 (Рисунок 2E,F).

2. Использование линии луча на алмазном источнике света

ПРИМЕЧАНИЕ: Все взаимодействие с лучевой линией пользователями осуществляется удаленно с помощью интерфейса ISPyB¹¹ . Физическое присутствие на линии пучка не требуется, а данные собираются с помощью системы на основе очередей, а не планируются в определенное время. У пользователей будет предложение, связанное с их доступом к Diamond Light Source. На линии пучка каждой кристаллизационной пластине присваивается уникальное посещение, и она определяется как «контейнер» в ISPyB¹¹ по аналогии с шайбой, содержащей образцы при 100 К. Экраны оптимизации не могут быть созданы с помощью интерфейса SynchWeb, поэтому информация обычно добавляется в раздел комментариев (см. шаг 2.1.4.). Лицо, регистрирующее номерной знак, должно будет проверить адрес электронной почты, так как владелец таблички будет получать электронные письма, касающиеся изображений, а также уведомления о заполненных номерных знаках.

1. Регистрация номерных знаков
   1. Войдите в ISPyB с соответствующим Diamond FedID и выберите Proposals. Найдите интересующее предложение , прокрутив или введя номер предложения в строке поиска. Выберите «Отгрузка » из выпадающего меню под номером предложения (рис. 3A), после чего откроется окно «Отгрузки » с отгрузками в этом предложении. Нажмите кнопку +Добавить отправление в правом верхнем углу (Рисунок 3B), чтобы открыть окно Добавить новое отправление , присвойте отправлению имя, нажмите Automated/Imager, а затем нажмите кнопку Add Shipment в левом нижнем углу (рисунок 3C).
   2. В окне отгрузки (рисунок 3D) нажмите кнопку +Add Container, после чего отобразится вид страницы Add container (рисунок 3E). Выберите в раскрывающемся меню Тип контейнера любой из соответствующих типов пластин. Страница изменится в соответствии с выбранным типом контейнера. Введите штрих-код и название контейнера в соответствии с инструкциями по электронной почте от персонала Beamline, относящимися к экспериментальным планшетам. Обратите внимание, что он чувствителен к регистру.
   3. Выберите имидж-сканер VMXi 20 °C в раскрывающемся меню «Запрошенный имидж-сканер», график визуализации Фибоначчи в раскрывающемся меню «Расписание визуализации», экран кристаллизации в раскрывающемся меню «Экран кристаллизации» и имя пользователя в раскрывающемся меню «Владелец», нажмите кнопку «Просмотр» и введите правильный контактный адрес электронной почты в поле «Электронная почта» (рисунок 3F).
   4. Введите дополнительные сведения о табличке в поле Комментарии . Выберите соответствующий образец из выпадающего меню «Белок » и используйте аббревиатуру, зарегистрированную в UAS и одобренную Diamond в экспериментальном предложении. Введите то же имя в поле Имя образца ; Остальные поля оставьте пустыми.
   5. Щелкните значок +Пластина , чтобы воспроизвести образец на всю пластину и заполнить весь контейнер зелеными квадратами. Нажмите кнопку +Добавить контейнер в нижней части страницы, чтобы зарегистрировать табличку. Попросите сотрудника на линии пучка перенести пластину в соответствующий тепловизор, где она будет храниться и получать изображения. Визит будет сгенерирован, когда контейнер будет сохранен в имидж-сканерах, и пользователь получит электронное письмо со ссылкой на табличку и ее изображения.
2. Просмотр результатов визуализации
   1. Перейдите к интересующему вас предложению (шаги 2.1.1), выберите Контейнеры в раскрывающемся меню под номером предложения и просмотрите список доступных контейнеров для предложения. Выберите фильтрующие пластины, если присутствуют другие типы держателей образцов. Чтобы еще больше сузить область поиска, установите флажок Мои контейнеры, чтобы отображались только наиболее релевантные контейнеры, связанные с текущим идентификатором пользователя, вошедшего в систему. Щелкните соответствующий контейнер, наведя курсор на отдельную строку и щелкнув левой кнопкой мыши.
   2. После выбора контейнера отобразится новый вид, показывающий обзор таблички (Рисунок 4A). Щелкните каплю в представлении пластины в левой части дисплея, чтобы отобразить самое последнее изображение из соответствующего кадра. Используйте клавиши со стрелками для навигации между перетаскиваниями или выбирайте отдельные перетаскивания, используя мышь или курсор.
   3. Чтобы просмотреть исторические изображения капли, нажмите кнопку H и подождите, пока поверх текущего изображения скважины не появится всплывающая галерея изображений. Наведите курсор на отдельные изображения, чтобы обновить основное изображение.
   4. Оценивайте изображения, чтобы обозначить статус каждого дропа, нажимая кнопки от 0 до 9 . Чтобы просмотреть отдельные категории, откройте раскрывающееся меню Оценка в левом верхнем углу изображения. Ищите синие крестики на каждом из изображений, которые являются результатом работы алгоритма (CHiMP), обученного искать «кристаллы» на изображениях.
   5. Нажмите на кнопку с третьим значком под названием «Измерить » в правом верхнем углу изображения, чтобы получить доступ к измерительному инструменту. Чтобы использовать этот инструмент, щелкните и перетащите линию, и линейка удлинится и укажет расстояние в мкм.
   6. Чтобы запросить дополнительный сеанс обработки изображений, нажмите «Видимый » или « UV» в раскрывающемся списке рядом с заголовком «Действия » в нижней части страницы. Затем нажмите кнопку «Запросить визуализацию пластины ».
3. Выбор кристалла/CHiMP
   1. Чтобы добавить точки для сбора данных вручную, нажмите кнопку +Mark Point . Наведите курсор на нужную точку интереса и выберите. Подождите, пока не появится красный крестик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: За одну каплю можно создать до 100 объектов.
   2. Когда все точки отмечены, нажмите кнопку +Готово . Не забудьте также нажать кнопку +Готово , прежде чем пытаться измерять объекты. Чтобы добавить регионы для сбора данных с помощью сканирования сетки, нажмите кнопку +Отметить область . Щёлкните по верхней левой точке и перетащите вниз и вправо, чтобы создать область, которая будет сканироваться растром на линии пучка. Как и в случае с точками, нажмите кнопку +Готово , когда все нужные области будут созданы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше создать один большой регион, чем много маленьких.
   3. Обратите внимание на синие кресты уже на изображениях капель, которые являются результатом работы алгоритма, разработанного для автоматического определения местоположения кристаллических объектов (CHiMP). Чтобы визуализировать оценку кристаллизационных капель CHiMP, установите флажок Показать автоматические оценки , а затем измените раскрывающееся меню для Класс. Как правило, наиболее полезной настройкой здесь является вариант кристалла (рис. 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это новая функция, и она не гарантирует, что вы найдете все кристаллы, а также можете найти другие объекты, которые не являются кристаллами.
   4. После того, как все точки и регионы будут отмечены в соответствующих каплях, нажмите кнопку «Подготовка к сбору данных » внизу страницы.
4. Подготовка образцов для сбора данных
   1. Обратите внимание на список образцов, содержащих точки или области, выбранные на предыдущем шаге или автоматически расположенные (рис. 4C). Добавьте отдельные точки или регионы, нажав кнопку + , или добавьте все отображаемые выборки, нажав кнопку Добавить текущую страницу в очередь .
   2. Фильтры доступны для отображения только точек, регионов, автоматических точек или ручных точек. Чтобы отобразить только те образцы, которые не были сняты (т.е. подверглись воздействию рентгеновских лучей), нажмите на опции «Без данных » и «Не завершено » над кнопками фильтра.
   3. Выберите отдельные образцы, нажав на соответствующую строку, и обновите изображение в правой части экрана, чтобы отобразить правильную каплю и отдельную точку. Если в списке много образцов, увеличьте количество образцов, отображаемых на странице, выбрав раскрывающееся меню со значением 10 по умолчанию и до 100 в качестве максимального количества отображаемых образцов.
   4. После того, как все точки и регионы добавлены в очередь, убедитесь, что все параметры сбора экспериментальных данных связаны с каждым экспериментом.
      1. Используйте фильтры для Точка, Область, Вручную и Авто. Щёлкните по Точечному фильтру и установите флажок Выбрать все под кнопками фильтра, чтобы одновременно применить параметры ко всем выборкам, видимым в текущем списке Queued Samples .
      2. Выберите параметры эксперимента из выпадающего меню в правой части экрана под фотографией (рис. 4D). Для регионов выберите опцию цифрового мультиметра Grid Scan с шагом 10 микрон, 100-процентная передача. Для всех остальных точечных экспериментов выберите другие параметры в раскрывающемся меню.
      3. Для сбора данных об осцилляциях выберите опцию Omega Scan DMM 60 градусов 5-процентной передачи , чтобы собрать максимальный объем данных из отдельного образца. Применяйте небольшие вращения для очень маленьких кристаллов или радиационно-чувствительных образцов и изменяйте пропускание в зависимости от предыдущего опыта работы с конкретной формой кристаллов. После того, как все образцы будут правильно применены к экспериментальным параметрам, нажмите кнопку Queue Container (Контейнер очереди ) в нижней части страницы.
   5. Как только пластина достигнет вершины очереди, она будет представлена на линию пучка, будут собраны наборы данных, а затем она снова вернется в хранилище образцов в линии пучка. После завершения сбора данных с планшета найдите электронное письмо со ссылкой, по которой можно перейти для доступа к соответствующим данным.
5. Создание групп образцов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Группы образцов могут быть созданы для группировки похожих образцов по нескольким каплям или пластинам. Все наборы данных в этих группах выборок будут обрабатываться с помощью конвейера xia2.multiplex¹⁴ после обработки DIALS. Это может быть полезно при сборе большого количества очень маленьких клиньев данных, а также может быть полезно для увеличения соотношения сигнал/шум в экспериментах по связыванию лигандов.
   1. Выберите Sample Group Management (Управление группой образцов) в раскрывающемся меню под номером предложения. Найдите список групп, если они уже были созданы другими пользователями. Чтобы создать новую группу, нажмите кнопку +Создать группу образцов. Щелкните отгрузку в раскрывающемся меню на странице Create Sample Group, чтобы открыть средство просмотра образцов (рисунок 5A). Щелкните контейнер, содержащий соответствующие выборки, из заполненного списка.
   2. При нажатии на контейнер найдите графику, показывающую обзор пластины.
   3. Щелкните перетаскивания, щелкнув по отдельному перетапливанию (рис. 5B) или щелкните перетаскивание в строках или столбцах, щелкнув соответствующую букву строки или номер столбца. После выбора всех скважин, связанных с отдельной группой, введите имя группы в поле Имя группы образцов и нажмите кнопку Сохранить группу образцов . Нажмите кнопку View Sample Groups на этой странице, чтобы вернуться к списку уже созданных групп выборок, связанных с предложением (рисунок 5C).
6. Редактирование групп выборки
   1. Выберите группу образцов из списка групп на странице Управление выборочными группами .
   2. Нажмите кнопку +Edit Sample Group рядом с контейнерами, которые отображаются под информацией о группе (рисунок 5C).
   3. Обратите внимание на капли, уже связанные с группой образцов, выделенные на обзоре пластины.
   4. Добавьте дополнительные капли в группу образцов, щелкнув капли, лунки или столбцы, как и раньше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капли не могут быть удалены из группы образцов.
   5. После добавления дополнительных дропов отредактируйте имя группы образцов , а затем сохраните его или просто сохраните, нажав кнопку «Сохранить группу образцов ».
7. Визуализация и анализ выходных данных групп выборок
   1. Выберите отдельную группу из списка групп образцов, чтобы отобразить обзор пластин контейнера или контейнеров, связанных с группой. Капли, входящие в группу, будут выделены на этом дисплее (рис. 5D).
   2. Найдите список, содержащий хронологические последние три мультиплексных задания, если данные были собраны в этой группе.
   3. Щелкните строку мультиплексного прогона, чтобы обновить результаты обработки, приведенные ниже.
   4. Обратите внимание на кнопку быстрой ссылки , которая показывает количество наборов данных, связанных с группой. Нажмите эту кнопку, чтобы открыть новую страницу Коллекции данных , отображающую отдельные коллекции наборов данных.

3. Доступ к автоматической обработке данных

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как данные собраны, они проходят через несколько конвейеров автоматической обработки данных. Четыре стандартных конвейера, используемых по пучковым линиям MX в Diamond, также работают на данных, собранных на пучковой линии. Это 'fast_dp', 'xia2 dials', 'xia2 3dii' и '^autoPROC'15. «fast_dp» обеспечит быстрое сокращение данных для быстрой оценки качества. Остальные три конвейера потребуют больше времени вычислений и будут запускать множество различных программных пакетов для сокращения объема данных для сравнения. Соответственно, выход обычно более высокого качества, чем выход 'fast_dp'. Наборы данных, собранные на линии пучка, также будут проходить через программное обеспечение для автоматического слияния мультикристаллов xia2.multiplex'14, которое объединит все наборы данных в определенную группу. Обратите внимание, что, хотя сканирование сетки в настоящее время не обрабатывается автоматически, данные можно обработать вручную с помощью конвейера xia2.ssx. Результаты конвейеров автоматической обработки можно найти в ISPyB¹¹ по следующему протоколу.

1. Поиск наборов данных
   1. Войдите в ISPyB, как описано выше, и выберите «Предложения».
   2. Найдите интересующее предложение , прокрутив или введя номер предложения в строку поиска.
   3. Выберите нужное посещение из списка, который появится на экране, чтобы получить доступ к окну Коллекции данных для этого посещения.
   4. Примените любые желаемые фильтры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Популярным фильтром является фильтр "Автоматически интегрированный", который отображает только те наборы данных, которые успешно прошли через один или несколько конвейеров обработки. Это исключит сканирование сетки, так как в настоящее время оно не обрабатывается автоматически через ISPyB.
   5. Прокрутите страницу вниз, чтобы найти интересующий вас набор данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый набор данных будет отображать идентификатор образца, используемые экспериментальные параметры, средство просмотра дифракционных изображений, средство просмотра кристаллических изображений и график анализа каждого изображения для быстрого наблюдения за качеством данных.
2. Чтобы получить доступ к результатам автоматической обработки, выполните следующие действия:
   1. Перейдите на вкладку «Автоматическая обработка » под сводкой данных конкретного эксперимента, чтобы проверить результаты автоматического сокращения данных (рис. 6A).
   2. Щелкните различные вкладки, соответствующие различным конвейерам, чтобы просмотреть подробную сводку по каждому выходу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если группы выборок определены, будут две вкладки, соответствующие заданиям мультиплексирования. Один из них будет соответствовать слиянию всех наборов данных в группе до этого момента, а другой будет соответствовать слиянию наборов данных только в пределах этого перетаскивания.
   3. Нажмите кнопку «Журналы и файлы», чтобы загрузить результирующие файлы .mtz, если обработка прошла успешно, и все связанные файлы журналов. Нажмите на вкладку Downstream Processing под разделом Auto Processing, чтобы просмотреть выходные данные DIMPLE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DIMPLE будет работать только в том случае, если во время отправки образца был предоставлен PDB-файл.
   4. Нажмите на кнопку Logs & Files , чтобы загрузить любой результирующий вывод из DIMPLE.
3. Чтобы получить доступ к результатам группового мультиплексирования, откройте раскрывающееся меню в верхней части экрана с номером предложения , написанным на нем, и нажмите Sample Group Management. Нажмите на строку , соответствующую нужной группе в нужном контейнере. Прокрутите вниз, чтобы найти список мультиплексных выходов , соответствующих группе, представленной визуально диаграммой пластины.
   1. Нажмите на нужный мультиплексный выход из приведенного списка. Нажмите кнопку xxx Data Sets , где xxx — количество объединенных наборов данных (рисунок 6B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Откроется экран Коллекции данных , но будут показаны только наборы данных из выбранного мультиплексного задания.
   2. Перейдите на вкладку Автоматическая обработка в верхнем эксперименте.
   3. Щелкните вкладку Multiplex Processing , которая соответствует правильному количеству объединенных наборов данных.
   4. Нажмите кнопку Logs & Files, чтобы загрузить .mtz и соответствующие файлы журналов (как в шаге 3.2.3).
4. Доступ к результатам сканирования сетки
   1. Перейдите на экран Сбор данных для нужного посещения. Результаты сканирования сетки будут отображаться вместе со всеми собранными данными о повороте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результатов автоматической обработки не будет.
   2. На изображение кристаллической капли будет наложена сетка с тепловой картой, представляющей наличие дифракции. Щёлкните по квадрату , чтобы просмотреть дифракционное изображение для этой позиции в сетке. Щелкните раскрывающееся меню в верхней части изображения кристаллической колодцы , чтобы изменить то, что представляет тепловая карта. По умолчанию используется общая интенсивность дифракции, но она может быть изменена на общее количество пятен, расчетное разрешение или кадры без льда.

4. Повторная обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранные наборы данных могут быть повторно обработаны через интерфейс ISPyB¹¹ с использованием тех же конвейеров обработки, которые запускаются автоматически с измененными настройками, определенными пользователем. Может быть применена отсечка разрешения; Если известна симметрия/ячейка кристалла, то ее также можно определить, чтобы гарантировать, что конвейеры обработки работают в правильных настройках. Выбранные диапазоны изображений в определенных наборах данных также можно объединить с помощью доступных мультикристаллических конвейеров. Это может оказаться полезным, если систематическое радиационное повреждение приводит к тому, что последняя часть дифракционных изображений имеет низкое качество. Кроме того, пользователь может загрузить свои наборы данных, используя протокол, описанный выше, и запустить желаемое программное обеспечение для обработки данных локально, учебные пособия по которому находятся в свободном доступе в другом месте (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

1. Повторная обработка нескольких отдельных наборов данных
   1. Войдите в ISPyB и перейдите к интересующим вас наборам данных (шаг 3.1).
   2. Щелкните набор данных и щелкните значок шестеренки в строке заголовка набора данных (рис. 6), чтобы открыть окно повторной обработки.
   3. Настройте необходимые параметры и выберите, какие кадры будут включены в повторную обработку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон изображений может быть определен либо путем ввода диапазона в помеченные поля, либо путем щелчка и перетаскивания нужной области на графике анализа каждого изображения (Рисунок 7A).
   4. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Чтобы добавить еще один набор данных для индивидуальной обработки, щелкните значок шестеренки , и он появится в окне повторной обработки под первым набором данных. Поставьте галочку в поле Обрабатывать индивидуально .
   5. Нажмите кнопку Интегрировать .
2. Повторная обработка мультикристаллических данных
   1. Откройте окно повторной обработки из любого набора данных.
   2. Нажмите кнопку Multi-Crystal , чтобы открыть новый экран.
   3. Прокрутите вниз, чтобы найти серию графиков анализа каждого изображения, полученных в ходе экспериментов во время визита.
   4. Выберите конвейер обработки в раскрывающемся меню.
   5. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Определите любые пределы разрешения или известные параметры элементарной ячейки.
   6. Щелкните и перетащите, чтобы определить диапазоны изображений, которые будут включены в многокристальную повторную обработку (рис. 7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано на нескольких разных графиках, чтобы наборы данных из нескольких разных кристаллов были объединены.
   7. Нажмите кнопку Integrate (рисунок 7B).
3. Доступ к повторно обработанным данным
   1. Перейдите на страницу «Сбор данных » для конкретного посещения (шаги 3.1.1-3.1.3).
   2. Нажмите на кнопку « Повторная обработка » в верхней части экрана.
   3. Прокрутите вниз, чтобы найти нужную вакансию.
   4. Щелкните путь к файлу в правом столбце, чтобы открыть экран Коллекции данных для повторно обработанных данных.
   5. Откройте вкладку «Автообработка » и загрузите данные, как описано ранее (шаг 3.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все повторно обработанные задания можно идентифицировать по символу круговых стрелок рядом с именем конвейера.

Discussion

Мы описали полную процедуру от поступления образца белка в КФ до загрузки окончательных данных пользователем для дальнейшего применения. Важнейшими этапами являются получение высококачественного образца белка и соответствующих кристаллических сит с использованием либо коммерческих сит с разреженной матрицей, либо с использованием оптимизационных сит на основе установленных условий. Этот процесс может происходить в КФ, или пользователи могут выполнять процедуры кристаллизации в домашних лабораториях и подносить подходящие кристаллизационные пластины к линии пучка. Идентификация подходящих параметров сбора данных может быть важна для определенных образцов, особенно там, где есть радиационное повреждение. В большинстве случаев для ответа на научный вопрос вполне достаточно автоматизированной обработки данных, хотя пользователи сохраняют возможность повторной обработки с помощью инструментов лучевой линии, например, в тех случаях, когда пространственная группа неоднозначна или используется только начальная часть собранных данных для минимизации последствий радиационного повреждения.

Если подходящие кристаллы не получены в результате первоначальных кристаллизационных испытаний, то могут быть изучены изменения концентрации, чистоты белка или кристаллизационные сита, а также использование кристаллического затравки. Если кристаллы не дифрагируют до полезного разрешения на линии пучка, то можно использовать сканирование сетки с незатухающим пучком для оценки собственного дифракционного предела и элементарной ячейки кристаллов, чтобы направлять усилия по оптимизации. Кристаллы, которые слишком малы для сбора данных в планшетах (например, <10 мкм), могут быть пригодны для серийной кристаллографии или нанофокусных экспериментов (например, на алмазной линии VMXm). Решение структур с использованием данных VMXi, как правило, является простым путем молекулярной замены, особенно после появления Alphafold¹⁶ для создания эффективных моделей поиска. Если это не удастся, кристаллы могут быть собраны и криохлаждены с пластин для проведения обычных экспериментов с одноволновой аномальной дифракцией, многоволновой аномальной дифракцией или длинноволновой фазировкой.

К преимуществам этого метода можно отнести возможность получения быстрых, высококачественных наборов данных и обратной связи непосредственно с кристаллизационных пластин без необходимости возмущать кристаллы из среды, в которой они росли. Так называемый «ренессанс комнатной температуры» в структурной биологии делает акцент на структурах, полученных в некриогенных условиях, чтобы позволить исследовать более физиологическую значимость и динамику белков. Обычно достигается несколько более низкое разрешение, чем для оптимизированного криоохлаждаемого кристалла, но только в том случае, если установлены подходящие криоусловия и если кристаллы устойчивы к механическому обращению и открытию кристаллизационной капли³. Предстоящее применение, для которого этот конвейер очень хорошо подходит, — это крупномасштабный скрининг белково-лигандных комплексов или кампаний фрагментов при комнатной температуре при разработке лекарств. Лиганды или фрагменты могут быть либо сокристаллизованы, либо добавлены пипеткой или акустическим выбросом капли перед сбором данных при комнатной температуре. Другое применение заключается в быстром измерении данных со многих сотен или тысяч кристаллов высокоэффективным способом, а затем использовании программного обеспечения DIALS¹⁷ multiplex¹⁴ для извлечения изоморфных кластеров, которые могут представлять различные биологические объекты, или для установления статистически значимых различий между популяциями кристаллов, которые были обработаны по-разному или подверглись воздействию различных лигандов или сигналов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formulator	Formulatrix	on request	Liquid handling robot
Formulatrix imager	Formulatrix	on request	Crystallisation plate imager
Greiner CrystalQuick X	Greiner	Z617644	Crystallisation plate
Gryphon	Art Robbins Instruments	620-1000-10	Crystalisation robot
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	Crystallisation plate
Mosquito LCP	(SPT Labtech)	on request	Crystallisation robot
Rock Imager & Maker	Formualtrix	on request	Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion