אנו מודים לד"ר מל פאני מבית החולים בריגהם ונשים ובבית הספר לרפואה של הרווארד על המתנה האדיבה של הבקרה והאלפא-סינוקלאין המבטאים קווי דרוזופילה . אנו מכירים במקורות הבאים לתמיכה במענקים לד"ר אולסן: NINDS K08, מלגת ג'ורג' קוטציאס של האגודה האמריקאית למחלות פרקינסון, פרס החוקר המוקדם של מחלת הפרקינסון של משרד ההגנה.

זבובים המשמשים בבדיקה זו: בקרה: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; זבובי אלפא-סינוקלאין: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+; 1 ו -10 ימים לאחר האקלוסיה; זבובים זכרים ונקבות (מזווגים ולא מזווגים) (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת מזון הזבובים הצבועים
<ol><li>יש לערבב משחת כמוסת ג'ל כחולה לצבעי מאכל (ראו טבלת חומרים) עם מים מזוקקים ביחס של 1:1 (v/v). הערה: השתמשו בצבעי מאכל מסחריים המכילים רק צבעים שאינם נספגים, שכן צבעים כחולים מסוימים הוכחו כבעלי השפעות נוירו-פרוטקטיביות21.</li>
	<li>חממו במיקרוגל את הבקבוקונים של מזון זבובים המורכב מקמח תירס סטנדרטי (ראו טבלת חומרים) במרווחים של 10-15 שניות עד שהמזון נמס לנוזל או לתרחיץ. אין לאפשר לאוכל לרתוח.</li>
	<li>מוסיפים את תערובת הצבעים לכל בקבוקון מזון לקבלת צבע אחיד בין הבקבוקונים. ערבבו בתערובת הצבעים עד שהמזון יהיה כחול הומוגני (איור 1). מוסיפים כמות מתערובת הצבע הכחול כך שצבע המזון רווי, ואין שונות בצבע בין הבקבוקונים. הערה: שלב זה חייב להיעשות מיד לאחר microwaving, כמו המזון מתמצק במהירות. אם המזון מתמצק, חממו שוב את הבקבוקון במיקרוגל.</li>
	<li>השאירו את בקבוקוני המזון הצבוע להתייבש באוויר עד שהוא יתמצק. הניחו מגבת נייר דקה על פתחי בקבוקונים בזמן הייבוש כדי למנוע מזבובים תועים לנחות בבקבוקון.</li>
	<li>לאחר שהמזון התקרר והתמצק, העבירו את הזבובים שישמשו לבדיקה למזון הכחול. הערה: עבור בקבוקונים צרים (25 מ"מ), מומלץ להוסיף 9-14 זבובים לכל בקבוקון. עבור בקבוקונים רחבים (28.5 מ"מ), מומלץ להוסיף 10-20 זבובים לכל בקבוקון. הזבובים אינם מופרדים על ידי מין או ניסיון הזדווגות וכוללים אוכלוסייה מעורבת של זבובים זכרים ונקבות, עם נקבות מזווגות ולא מזווגות.</li>
	<li>לדגור על בקבוקונים עם זבובים לילה ב 25 °C (75 °F) באינקובטור.</li>
</ol>2. הדמיה של הזבובים
הערה: שלב זה הוא אופציונלי (איור 2).
<ol><li>למחרת בבוקר (זמן 0), להרדים את הזבובים המייצגים עם פחמן דו חמצני במשך 60 שניות. הניחו את הזבוב כך שהצד הגחוני פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>באמצעות מצלמה (ראו טבלת חומרים), לכדו תמונות של הזבובים בכל שעה כדי להמחיש את כמות המזון הכחול שנותרה במערכת העיכול. הערה: אין להשתמש בזבובים אלה עבור החלק הכמותי של הבדיקה (שלב 3), שכן הרדמה עלולה להשפיע על התוצאות.</li>
	<li>בכל שעה, להרדים ולצלם זבובים חדשים.</li>
</ol>3. ביצוע בדיקת עצירות
<ol><li>מעבירים את הזבובים הנותרים (שאינם מורדמים) לבקבוקונים עם מזון דרוזופילה סטנדרטי. מספר כל בקבוקון.</li>
	<li>השאירו את הזבובים באינקובטור ב 25 °C למשך 60 דקות.</li>
	<li>לאחר 60 דקות, מעבירים את הזבובים לבקבוקונים חדשים עם מזון דרוזופילה סטנדרטי. התחל להקליט נתונים מקבוצת הבקבוקונים הראשונה.</li>
	<li>ציירו קו מקווקו לאורך הבקבוקון כדי לסמן את הנקודה שממנה תתחיל הספירה.</li>
	<li>ספור ידנית את מספר הנקודות הקטנות והעגולות על הקיר של כל בקבוקון. אין לספור נקודות שנמצאו על תקע המזון או הבקבוקון.</li>
	<li>התחילו בספירת מספר הנקודות הכחולות על הקיר של כל בקבוקון.</li>
	<li>ספרו את מספר הנקודות האטומות וחסרות הצבע על הקיר של כל בקבוקון. הערה: כל נקודה היא צואת זבובים, שהיא שילוב של שתן וחומר צואתי22. לעיתים, זבוב עשוי ללכת על הצואה ולהשאיר שובל, ובמקרה זה, לספור רק את הנקודה המקורית, ולא כל סימן בודד בשביל.</li>
	<li>רשום את היחס בין נקודות כחולות למספר הכולל של נקודות עבור כל בקבוקון. הערה: מספר הנקודות הכולל הוא מספר הנקודות הכחולות על קיר בקבוקון שנוסף למספר הנקודות חסרות הצבע על הקיר של אותו בקבוקון. זה ישמש לחישוב אחוז חומר צואה כחול לשעה.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.2-3.8 שבע פעמים נוספות, ואסוף נתונים בכל שעה במשך 8 שעות בסך הכל.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>גרף את אחוז החומר הצואה הכחול לשעה עבור כל מצב.</li>
	<li>השווה את הנתונים בין התנאים. הערה: ניתן לקבוע מובהקות סטטיסטית בשלוש דרכים: על ידי השוואת נקודות זמן בודדות בין תנאים, על ידי מדידת שיפוע הקו לאורך זמן, או על ידי השוואת השטח מתחת לעקומה.</li>
</ol>

בדיקות עצירות בזבובי דרוזופילה

<ol>
	<li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li><li>Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).</li><li>Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+and+the+environment.">Parkinson's disease and the environment.</a> Front Neurol. 10, 218 (2019).</li><li>Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neuron+challenge+test+for+early+detection+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116 (2021).</li><li>Ueki, A., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+style+risks+of+Parkinson's+disease:+association+between+decreased+water+intake+and+constipation.">Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation.</a> J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).</li><li>Houser, M. C., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut-brain+axis:+is+intestinal+inflammation+a+silent+driver+of+Parkinson's+disease+pathogenesis.">The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis.</a> NPJ Parkinsons Dis. 3, 3 (2017).</li><li>Pfeiffer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motor+symptoms+in+Parkinson's+disease.">Non-motor symptoms in Parkinson's disease.</a> Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).</li><li>Klann, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gut-brain+axis+and+its+relation+to+parkinson's+disease:+A+review.">The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review.</a> Front Aging Neurosci. 13, 782082 (2021).</li><li>Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Gut dysfunction in Parkinson's disease.</a> World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).</li><li>Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+and+the+gut:+symptoms,+nutrition,+and+microbiota.">Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).</li><li>Chen, S. J., Lin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microenvironmental+changes+as+a+potential+trigger+in+Parkinson's+disease+through+the+gut-brain+axis.">Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis.</a> J Biomed Sci. 29 (1), 54 (2022).</li><li>Hawrysh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRKN/parkin-mediated+mitophagy+is+induced+by+the+probiotics+Saccharomyces+boulardii+and+Lactococcus+lactis.">PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis.</a> Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).</li><li>Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestine-derived+&#945;-synuclein+initiates+and+aggravates+pathogenesis+of+Parkinson's+disease+in+Drosophila.">Intestine-derived &#945;-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila.</a> Transl Neurodegener. 11 (1), 44 (2022).</li><li>Rota, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constipation,+deficit+in+colon+contractions+and+alpha-synuclein+inclusions+within+the+colon+precede+motor+abnormalities+and+neurodegeneration+in+the+central+nervous+system+in+a+mouse+model+of+alpha-synucleinopathy.">Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy.</a> Transl Neurodegener. 8, 5 (2019).</li><li>Diwakarla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATH434+reverses+colorectal+dysfunction+in+the+A53T+mouse+model+of+Parkinson's+disease.">ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).</li><li>Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+Induces+mitochondrial+dysfunction+through+spectrin+and+the+actin+cytoskeleton.">&#945;-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton.</a> Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).</li><li>Olsen, A. L., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+&#945;-synuclein+promotes+neurodegeneration+characterized+by+a+distinct+transcriptional+program+in+vivo.">Glial &#945;-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo.</a> Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).</li><li>Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+and+systemic+signals+couple+nutritional+and+reproductive+status+with+intestinal+homeostasis.">Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis.</a> Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).</li><li>Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interplay+in+Drosophila+melanogaster:+chronic+nutritional+deprivation+in+larval+life+affects+adult+fecal+output.">Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output.</a> J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).</li><li>Popovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+dPerk+in+the+intestine+suppresses+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Cell Death Dis. 14 (3), 206 (2023).</li><li>Poteet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+actions+of+methylene+blue+and+its+derivatives.">Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives.</a> PLoS One. 7 (10), e48279 (2012).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Schlichting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+network+underlying+circadian+entrainment+and+photoperiodic+adjustment+of+sleep+and+activity+in+Drosophila.">A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila.</a> J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ישנם מספר שלבים בפרוטוקול זה שיסייעו לסיום מוצלח של הבדיקה. ראשית, חשוב לוודא שמרווחי הזמן בין כל סבב לכל בקבוקון יהיו עקביים לאורך כל הניסוי. תיוג הבקבוקונים במספרים יעזור למנוע את הצורך בתיאורי גנוטיפ ארוכים, ויחסוך זמן. בנוסף, חיוני שהשיטה לספירת חומר צואתי22 תישאר עקבית לאורך כל הניסוי. בעוד חומר צואתי כחול נראה על מזון תקע בקבוקון, חומר צואה חסר צבע לא. לכן, אין לספור את הנקודות הכחולות על תקע המזון או הבקבוקון.
עם בדיקות התנהגותיות, תמיד קיימת אפשרות של חוסר עקביות בתוצאות עקב תנודות בהתנהגות הזבוב או משתנים לא ידועים המשפיעים על הבדיקה. אנו ממליצים להשתמש באותה מדיה של דרוזופילה , באותו צבע מאכל ובאותו מותג בקבוקונים לכל הניסויים. באופן מעניין, במספר ניסויים נצפה כי זבובים נוטים לעשות את צרכיהם בתדירות נמוכה יותר בשעות אחר הצהריים המוקדמות, אולי בגלל השעון הביולוגי של הזבובים23. עם זאת, התנהגות זו עקבית הן בזבובי ביקורת והן בזבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין, ולכן היא לא צריכה לעורר חששות.
אם הזבובים אינם מפרישים חומר צואתי כחול בתחילת הבדיקה, ייתכן שהצבע בו משתמשים אינו פיגמנטי מספיק. במקרה זה, ניתן להגדיל את היחס בין צבע למים מזוקקים בהתאם. ייתכן גם שכאשר נשארת רק כמות קטנה של מזון כחול במערכת העיכול של הזבוב, ייתכן שיהיה קשה לקבוע אם החומר הצואתי הוא כחול בהיר או חסר צבע. כאשר זה קורה, הצבת גיליון נייר לבן מאחורי בקבוקון יעזור לקבוע את הצבע של נקודה צואה. גם אם החומר הצואתי הוא כחול בהיר מאוד, עדיף לרשום אותו כחומר צואתי כחול ולא כחומר צואתי חסר צבע.
מגבלה אחת של בדיקה זו היא שהיא דורשת ספירה ידנית של כתמי צואה. כדי לשפר את הפוטנציאל לסינון בתפוקה גבוהה, פרוטוקול זה עשוי להשתנות בעתיד כדי לאפשר כימות אוטומטי של כתמי צואה כחולים המיוצרים על ידי זבובים בודדים בצלחות מרובות בארות. מגבלה נוספת היא שלמרות שלמודל אלפא-סינוקלאין יש פוטנציאל להתפתח למודל פרודרומלי של פרקינסון, עדיין לא זוהתה נקודת זמן אופטימלית שבה עצירות קיימת ללא ניוון עצבי.
לסיכום, שיטה זו מציעה גישה פשוטה ופשוטה למידול עצירות, תסמין פרקינסון לא מוטורי שלא נחקר מספיק, במודל דרוזופילה של פרקינסון.

מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת המאופיינת קלינית בנוכחות תסמינים מוטוריים כגון ברדיקינזיה, נוקשות ורעד, וכתוצאה מכך תחלואה משמעותית1. מבחינה פתולוגית, מחלת פרקינסון מוגדרת על ידי אובדן נוירונים דופמינרגיים בחומר השחור וקיפול שגוי של אלפא-סינוקלאין, מה שמוביל להיווצרות גופי לוי ונויריטים לויים. הפתוגנזה של מחלת פרקינסון עדיין אינה מובנת היטב, ככל הנראה כתוצאה מיחסי גומלין מורכבים של גורמים גנטיים וסביבתיים 2,3. נכון לעכשיו, טיפולים משנים מחלה אינם זמינים, אולי בשל השלב המתקדם של הפתולוגיה הקיימת בזמן האבחון. מחקרים הראו כי יותר מ -60% מהנוירונים הדופמינרגיים בחומר השחור כבר אבדו עם הופעת הסימפטומים המוטוריים, מה שמדגיש את הצורך לחקור סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לגילוי מוקדם של מחלות4. סמן ביולוגי קליני אחד כזה הוא עצירות, הנפוצה בקרב חולי פרקינסון 5,6 ועשויה להקדים את הופעת התסמינים המוטוריים בשנים ואף עשרות שנים.
למרות ההגדרה הקלינית של פרקינסון המבוססת על תסמינים מוטוריים, עצירות היא אחד ממספר תסמינים לא מוטוריים המאתגרים יותר לטיפול סימפטומטי וגורמים לפגיעה משמעותית באיכות החיים של החולים7. שינויים בציר מעי-מוח, המייצג תקשורת דו-כיוונית בין המוח למערכת העצבים האנטרית, היו מעורבים בפתוגנזה של פרקינסון. אגרגטים של אלפא-סינוקלאין נמצאו בדגימות רקמה ממערכת העיכול של חולי פרקינסון8, ומודלים של בעלי חיים מציעים כי אגרגטים של אלפא-סינוקלאין במערכת העצבים האנטרית התפשטו באופן דמוי פריון למערכת העצבים המרכזית9. נוסף על כך, חולי פרקינסון מפגינים חריגות במיקרוביום המעי10 ועלולים לחוות דלקת מעיים מוגזמת11. עצירות בפרקינסון לא נחקרה מספיק, עם מעט מודלים מדווחים של עצירות הקשורה לפרקינסון בזבובים12,13 או מכרסמים14,15.
בדיקה זו משתמשת במודל דרוזופילה של פרקינסון שבו זבובים מבטאים את הגן אלפא-סינוקלאין האנושי תחת שליטתו של נהג פאן-עצבי, n-synaptobrevin. זבובים אלה מציגים את כל המאפיינים הבולטים של מחלת פרקינסון, כולל צבירת אלפא-סינוקלאין, תפקוד מוטורי לקוי וניוון עצבי הקשור לגיל, וכתוצאה מכך אובדן נוירונים דופמינרגיים16,17. מחקרים קודמים הציגו מדידה של תפוקת צואה בזבובים כדי להעריך תפקוד לקוי של המעיים, כימות חומר צואתי של זבובים והשוואת כמויות הפרשות על פני קווים גנטיים שונים כדי לגלות הבדלים תפקודיים במערכת העיכול 18,19,20. כאן, אנו מדגימים את בדיקת העצירות באמצעות זבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי. כלי פשוט אך רב ערך זה מאפשר לחקור סימפטום לא מוטורי חשוב של פרקינסון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1400 g sucrose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>904713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1800 g dextrose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>901521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2884 g yeast</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>903312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>428 g agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10253156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4600 mL molasses</td>
			<td>Grandma&#39;s Molasses</td>
			<td>7971942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68 L water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6864 g cornmeal</td>
			<td>Pearl Milling</td>
			<td>125045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Standard software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aper</td>
			<td>111ACS200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flugs for wide plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>49-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 9.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus DP23 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12 Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25470A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A258 - 500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft gel paste food color, Royal blue</td>
			<td>AmeriColor</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4</td>
			<td>All lines provided by Dr. Mel Feany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lines are available directly from Dr. Feany&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring constipation in a drosophila model of parkinson's disease

תסמינים לא מוטוריים במחלת פרקינסון (PD) שכיחים, קשים לטיפול ופוגעים משמעותית באיכות החיים. סימפטום לא מוטורי שכיח אחד הוא עצירות, אשר יכולה להקדים את האבחנה של PD בשנים או אפילו עשרות שנים. עצירות לא נחקרה מספיק במודלים של פרקינסון בבעלי חיים וחסרה טיפולים ספציפיים. בדיקה זו משתמשת במודל דרוזופילה של פרקינסון שבו אלפא-סינוקלאין אנושי מבוטא תחת מניע פאן-עצבי. זבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין מפתחים את המאפיינים הבולטים של מחלת פרקינסון: אובדן נוירונים דופמינרגיים, ליקוי מוטורי ותכלילי אלפא-סינוקלאין.
פרוטוקול זה מתווה שיטה לחקר עצירות בזבובים אלה. זבובים מונחים על מזון זבובים עם תוסף צבע כחול במשך הלילה ולאחר מכן מועברים מזון רגיל למחרת. לאחר מכן הם מועברים לבקבוקונים חדשים עם מזון זבובים סטנדרטי כל שעה במשך 8 שעות. לפני כל העברה מחושב אחוז כתמי הצואה בצבע כחול בהשוואה לסך כתמי הצואה על דופן הבקבוקון. זבובי בקרה חסרי אלפא-סינוקלאין מגרשים את כל הצבע הכחול שעות לפני שזבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין. בנוסף, ניתן לעקוב אחר מעבר המזון בצבע כחול מהמעיים באמצעות צילום פשוט. הפשטות של בדיקה זו מאפשרת את השימוש בו במסכים גנטיים או כימיים קדמיים כדי לזהות משנים של עצירות בדרוזופילה.

Parkinson&#39;s disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized clinically by the presence of motor symptoms such as bradykinesia, rigidity, and tremor, resulting in significant morbidity1. Pathologically, PD is defined by the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra and the misfolding of alpha-synuclein, leading to the formation of Lewy bodies and Lewy neurites. The pathogenesis of PD remains poorly understood, likely arising from a complex interplay of genetic and environmental factors2,3. Currently, disease-modifying therapies are unavailable, possibly due in part to the advanced stage of pathology present at the time of diagnosis. Studies have shown that more than 60% of dopaminergic neurons in the substantia nigra have already been lost by the onset of motor symptoms, underscoring the need to explore potential biomarkers for early disease detection4. One such clinical biomarker is constipation, which is common in PD patients5,6 and may precede motor symptom onset by years or even decades.
Despite PD&#39;s clinical definition based on motor symptoms, constipation is one of several non-motor symptoms that are more challenging to treat symptomatically and cause significant impairment in patients&#39; quality of life7. Alterations in the gut-brain axis, which represents bidirectional communication between the brain and the enteric nervous system, have been implicated in PD pathogenesis. Alpha-synuclein aggregates have been found in tissue samples from the gastrointestinal tracts of PD patients8, and animal models suggest that alpha-synuclein aggregates in the enteric nervous system spread in a prion-like manner to the central nervous system9. Additionally, PD patients exhibit abnormalities in the gut microbiome10 and may experience excessive gut inflammation11. Constipation in PD has been understudied, with few reported models of Parkinson&#39;s-associated constipation in flies12,13or rodents14,15.
This assay employs a Drosophila model of PD in which flies express the human alpha-synuclein gene under the control of a pan-neuronal driver, n-synaptobrevin. These flies exhibit all the hallmark features of PD, including alpha-synuclein aggregation, motor dysfunction, and age-related neurodegeneration, resulting in the loss of dopaminergic neurons16,17. Previous studies have introduced the measurement of fecal output in flies to assess gut dysfunction, quantifying fly fecal matter and comparing excreta amounts across various genetic lines to reveal functional differences in the digestive system18,19,20. Here, we demonstrate the constipation assay using flies expressing human alpha-synuclein. This simple yet valuable tool enables the study of an important non-motor symptom of PD.

מחבר זרקור: חקר תסמינים לא מוטוריים במחלת פרקינסון 

מדידת עצירות במודל דרוזופילה של מחלת פרקינסון

Parkinson's disease is defined by the motor symptoms of bradykinesia, tremor, and rigidity. But many patients with Parkinson's disease suffer from non-motor symptoms, which are harder to treat and cause greater impairment in quality of life. These have not been well studied in animal models of the disease, which limits our abilities to find new therapies for them.This protocol is simple and inexpensive, but generates reproducible results. It is easy to learn and requires no specialized equipment. With this simple assay, we can assess constipation in flies that have neurodegeneration.In the future, we hope to develop a model where flies develop constipation before the onset of neurodegeneration. This will allow us to better understand the pathogenesis of Parkinson's disease.

מכיוון שהבטן של דרוזופילה שקופה, ניתן לדמיין מזון כחול בתוך המעיים בזבובים מורדמים חיים. ניתן להעריך הבדלים איכותיים במעבר המעי על ידי צילום תמונות של הזבובים בנקודות זמן שונות. בזבובי ביקורת, המזון הכחול מגורש במהירות, בעוד שבזבובי אלפא-סינוקלאין, המזון הכחול נשאר נוכח במעיים למשך 8 שעות (איור 2).
זבובי אלפא-סינוקלאין מציגים ניוון עצבי הקשור לגיל, עם פנוטיפ חזק המתפתח עד 10 ימים לאחר האקלוסיה10. בנקודת הזמן הזו, הבדלים בזמן המעבר של המעי בהשוואה לזבובי ביקורת נראים על-ידי השוואת נקודות זמן בודדות בין תנאים, על-ידי מדידת שיפוע הקו לאורך זמן, או על-ידי השוואת השטח שמתחת לעקומה (איור 3). לא נצפו הבדלים במעבר המעיים בין זבובי הבקרה לזבובי אלפא-סינוקלאין בנקודת זמן מוקדמת יותר, ביום הראשון שלאחר האקלוסיה, כאשר גם תפקוד מוטורי לקוי וניוון עצבי עדיין אינם נוכחים (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2.jpg"> איור 1: בקבוקוני מזון כחולים וכתמי צואה. (A) כל הבקבוקונים מכילים מזון בצבע כחול. בנקודה זו בזמן, זבובים הוכנסו זה עתה למזון הכחול, ואין חומר צואתי כחול גלוי. (B) בקבוקון לאחר W1118 הועבר למזון טרי למשך שעה אחת, ואז הוסר. הכניסה השמאלית מוגדלת ב- (C), והכניסה הימנית מוגדלת ב- (D). (ג) אזור שהוחרג מהניתוח בשל הימצאות מזון לזבובים. (D) תצוגה מוגדלת של כתמי צואה, המציינת כתמים כחולים (חצים שחורים) וכתמים שאינם כחולים (חיצים צהובים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig02.jpg"> איור 2: הדמיה של מעבר מעיים של מזון צבוע לאורך זמן. זבובי בקרה וזבובי ביקורת המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי בתאי עצב הושארו על מזון צבוע כחול למשך הלילה ולאחר מכן הועברו למדיה סטנדרטית למחרת. זבובים הועברו באופן סדרתי למזון זבובים סטנדרטי חדש בכל שעה. מוצגות תמונות מייצגות בזמן אפס ו- 2, 4, 6 ו- 8 שעות לאחר ההעברה. זבובי בקרה ואלפא-סינוקלאין מראים כתמים דומים של מזון כחול במעיים בזמן אפס. בנקודות הזמן הבאות, לזבובי הבקרה יש פחות מזון כחול מאשר לזבובי אלפא-סינוקלאין, וכל המזון הכחול נעלם בנקודת הזמן של 8 שעות בזבובי הביקורת. הגנוטיפים עבור כל קו זבוב הם כדלקמן: בקרה (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); זבובי אלפא-סינוקלאין (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+). נקבות זבובים משמשות להדמיה בשל יכולתן הקלה יותר לדמיין את הבטן בגלל גודלן הגדול יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2.jpg"> איור 3: בדיקת עצירות בזבובים שלאחר אקלוסיה ביום ה-10. זבובי ביקורת וזבובי ביקורת המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי בתאי עצב הושארו על מזון צבוע כחול למשך הלילה ולאחר מכן הועברו למזון זבובים סטנדרטי למחרת. זבובים הועברו באופן סדרתי למדיה סטנדרטית חדשה בכל שעה. (A) אחוז חומר צואתי כחול לשעה. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. N = 6 בקבוקונים לכל גנוטיפ; כל בקבוקון הכיל 9-14 זבובים. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו ב-Graphpad Prism (ראו טבלת חומרים). מובהקות סטטיסטית בכל נקודת זמן חושבה באמצעות ANOVA דו-כיוונית. שיפוע הקו וההפרש בין השיפועים חושבו באמצעות ניתוח רגרסיה ליניארית. (B) השטח מתחת לעקומה עבור כל גנוטיפ חושב. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. הגנוטיפים עבור כל קו זבוב הם כדלקמן: בקרה (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); זבובי אלפא-סינוקלאין (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+). גם הזבובים הזכרים וגם הזבובים הנקביים נכללים במספרים שווים פחות או יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2.jpg"> איור 4: בדיקת עצירות בזבובים שלאחר אקלוסיה ביום הראשון. זבובי בקרה וזבובי ביקורת המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי בתאי עצב הושארו על מזון צבוע כחול למשך הלילה ולאחר מכן הועברו למדיה סטנדרטית למחרת. זבובים הועברו באופן סדרתי למזון זבובים סטנדרטי חדש בכל שעה. (A) אחוז חומר צואתי כחול לשעה. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. N = מינימום 5 בקבוקונים לכל גנוטיפ; כל בקבוקון הכיל 9-14 זבובים. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו ב-Graphpad Prism. מובהקות סטטיסטית בכל נקודת זמן חושבה באמצעות ANOVA דו-כיוונית. שיפוע הקו וההפרש בין השיפועים חושבו באמצעות ניתוח רגרסיה ליניארית. (B) השטח מתחת לעקומה עבור כל גנוטיפ חושב. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. הגנוטיפים עבור כל קו זבוב הם כדלקמן: בקרה (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); זבובי אלפא-סינוקלאין (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+). גם הזבובים הזכרים וגם הזבובים הנקביים נכללים במספרים שווים פחות או יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Non-Motor Symptoms in Parkinson's Disease at JoVE.com

פרוטוקול זה מציג בדיקה למידול עצירות במודל דרוזופילה מבוסס אלפא-סינוקלאין של מחלת פרקינסון.

Non-motor symptoms in Parkinson's disease (PD) are common, difficult to treat, and significantly impair quality of life. One prevalent non-motor symptom ...

מחלת פרקינסון מוגדרת על ידי הסימפטומים המוטוריים של ברדיקינזיה, רעד ונוקשות. אך חולי פרקינסון רבים סובלים מתסמינים לא מוטוריים, שקשים יותר לטיפול וגורמים לפגיעה גדולה יותר באיכות החיים. אלה לא נחקרו היטב במודלים של בעלי חיים של המחלה, מה שמגביל את יכולתנו למצוא טיפולים חדשים עבורם.פרוטוקול זה הוא פשוט וזול, אך מייצר תוצאות הניתנות לשחזור. זה קל ללמוד ולא דורש ציוד מיוחד. עם בדיקה פשוטה זו, אנו יכולים להעריך עצירות אצל זבובים שיש להם ניוון עצבי.בעתיד, אנו מקווים לפתח מודל שבו זבובים מפתחים עצירות לפני תחילת ניוון עצבי. זה יאפשר לנו להבין טוב יותר את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון.

מדידת עצירות במודל דרוזופילה של מחלת פרקינסון

Abstract