Um método eficiente e rápido para rotular e analisar glomérulos de camundongos

Summary

Este estudo apresenta um conjunto fácil de usar, completo e simples de métodos para marcar e analisar glomérulos de rins de camundongos eliminados pela CUBIC. Dados como número e volume de glomérulos podem ser obtidos de forma fácil e confiável usando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextran, microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) ou microscopia confocal comum e software como Imaris.

Abstract

Os glomérulos são unidades fundamentais no rim; portanto, o estudo dos glomérulos é fundamental para a compreensão da função renal e da patologia. As imagens biológicas fornecem informações intuitivas; Assim, é de grande importância rotular e observar os glomérulos. No entanto, os métodos de observação de glomérulos atualmente em uso requerem operações complicadas, e os resultados podem perder detalhes do rótulo ou informações tridimensionais (3D). A tecnologia de limpeza de tecido de análise computacional (CUBIC) tem sido amplamente utilizada em pesquisas renais, permitindo uma detecção mais precisa e profundidade de detecção mais profunda. Descobrimos que os glomérulos de camundongos podem ser marcados rápida e efetivamente por injeção na veia caudal de FITC-Dextran de peso molecular médio seguida pelo método de limpeza cúbica. O rim de camundongo limpo poderia ser escaneado por um microscópio de folha de luz (ou um microscópio confocal quando fatiado) para obter pilhas de imagens tridimensionais de todos os glomérulos em todo o rim. Processados com software apropriado, os sinais dos glomérulos poderiam ser facilmente digitalizados e posteriormente analisados para medir o número, volume e frequência dos glomérulos.

Introduction

O número e o volume dos glomérulos são muito importantes para o diagnóstico e tratamento de diversas doenças renais1,2,3,4,5. O padrão-ouro da estimativa do número de glomérulos é a combinação dissector físico/fracionador. Entretanto, esse método requer reagentes e equipamentos especiais, tornando-o lento e dispendioso 6,7,8,9. A biópsia fornece uma riqueza de informações, mas ob....

Protocol

Camundongos adultos C57BL/6 (6 semanas de idade, 25-30 g) foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas locais de bem-estar animal e ética experimental. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan.

1. Marcação de glomérulos e preparação de tecidos

1. Rotulagem de glomérulos
   1. Dissolver FITC-dextran (10 mg) em 1x solução salina .......

Discussion

As tecnologias de desobstrução tecidual podem ser classificadas em 3 ou 4 grupos 29,30,31. A limpeza de tecidos à base de solventes orgânicos (por exemplo, DISCO e PEGASOS), a limpeza de tecidos à base de água (por exemplo, CUBIC) e a limpeza de tecidos incorporados a hidrogel (por exemplo, CLARITY) foram aplicadas na limpeza renal 25,26,28,32.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent