A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.
אתגר מרכזי בהבנת הגורמים לאי פוריות נשית הוא להבהיר מנגנונים השולטים בהתפתחות תאי נבט נקביים, הנקראים ביציות. התפתחותם מסומנת על ידי צמיחת תאים וחטיבות עוקבות, שני שלבים קריטיים המכינים את הביצית לאיחוי עם הזרע כדי ליזום אמבריוגנזה. במהלך הגדילה, הביציות מארגנות מחדש את הציטופלסמה שלהן כדי למקם את הגרעין במרכז התא, אירוע המנבא התפתחות מוצלחת של ביציות בעכברים ובבני אדם, ובכך את הפוטנציאל האמבריוגני שלהן. בביציות עכבר, ארגון מחדש ציטופלזמי זה הוכח כמונע על ידי השלד הציטופלזמה, שפעילותו יוצרת כוחות מכניים המתסיסים, ממקמים מחדש וחודרים לגרעין. כתוצאה מכך, העברת כוח ציטופלזמית לנוקלאופלזמית זו מכווננת את הדינמיקה של אברוני עיבוד RNA גרעיניים הידועים כמעבים ביומולקולריים. פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתעד, ברזולוציה טמפורלית גבוהה, את השפעת השלד על הגרעין על פני קני מידה מרחביים בביציות עכבר. הוא מפרט את שלבי ההדמיה וניתוח התמונה והכלים הדרושים כדי להעריך א) פעילות ציטו-שלד בציטופלסמה של הביצית, ii) תסיסה מבוססת שלד של גרעין הביצית, ו-iii) השפעותיה על דינמיקת עיבוי ביומולקולרית בנוקלאופלזמה של הביצית. מעבר לביולוגיה של הביציות, ניתן להתאים את השיטות המתוארות כאן לשימוש בתאים סומטיים כדי לטפל באופן דומה בכוונון מבוסס שלד של דינמיקה גרעינית על פני קני מידה.
מיקום גרעיני חיוני עבור פונקציות תאיות והתפתחותיות מרובות 1,2,3,4,5. תאי נבט נקביים של יונקים בשם ביציות מעצבים מחדש את הציטופלסמה שלהם כדי למקם את הגרעין במרכז התא למרות שהם עוברים חלוקה אסימטרית בגודל, אשר מסתמכת על כרומוזום עוקב מחוץ למרכז6 (איור 1). מרכוז זה של הגרעין מנבא התפתחות ביציות מוצלחת בעכברים ובבני אדם 7,8, ולפיכך את הפוטנציאל האמבריוגני שלהן (איור 1).<....
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הקהילה האירופית ואושרו על ידי משרד החקלאות הצרפתי (אישור מס' 75-1170) ועל ידי Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; הסכם GMO מספר DUO-5291). עכברים שוכנו במתקן בעלי החיים במחזור אור / חושך של 12 שעות, עם טמפרטורת סביבה של 22-24 מעלות צלזיוס ולחות של 40%-50%. עכברים המשמ.......
לוחות תמונה באיור 3 מראים דוגמאות של ביצית טיפוסית שגדלה במלואה (איור 3A), הנוקלאופלזמה בביצית בוגרת במלואה המבטאת YFP-Rango (איור 3B), הנוקלאופלזמה בביצית בוגרת במלואה מבטאת נכונות (פאנל שמאלי; איור 3C) או מוגזם (פאנל ימני;
השלבים העיקריים בפרוטוקול זה כוללים מיקרו-הזרקה נכונה של ביציות מבלי להשפיע על הישרדותן או על תפקודן התקין 9,10,11, כמו גם מיקרו-הזרקה של כמויות מוגדרות מראש של cRNA שיאפשרו הדמיה נכונה של מבנים רלוונטיים, כמו כתמים גרעיניים.
קב.......
א.א.ג. ומ.א. כתבו במשותף את כתב היד וכל המחברים השותפים העירו על כתב היד. M. A. נתמך על ידי CNRS ו- "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. נתמך על ידי Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel ו- Fondation du Collège de France.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3311 | |
CSU-X1-M1 spinning disk | Yokogawa | ||
DMI6000B microscope | Leica | ||
Femtojet microinjector | Eppendorf | ||
Fiji | |||
Filter wheel | Sutter Instruments Roper Scientific | ||
Fluorodish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
Metamorph software | Universal Imaging, | version 7.7.9.0 | |
Mineral oil | Sigma Aldrich | M8410-1L | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
OF1 and C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
Poly(A) Tailing kit | Thermo Fisher | AM1350 | |
Retiga 3 CCD camera | QImaging | ||
RNAeasy kit | Qiagen | 74104 | |
SC35 antibody | Abcam | ab11826 | Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400) |
SRSF2-GFP plasmid | OriGene Technologies | MG202528 | NM_011358 |
Stripper Micropipette | XLAB Solutions | specialized for oocyte collection | |
T3 mMessage mMachine | Thermo Fisher | AM1384 | |
T7 mMessage mMachine | Thermo Fisher | AM13344 | |
Thermostatic chamber | Life Imaging Service | ||
Windows Excel | Windows |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved