לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

Summary

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

Abstract

אתגר מרכזי בהבנת הגורמים לאי פוריות נשית הוא להבהיר מנגנונים השולטים בהתפתחות תאי נבט נקביים, הנקראים ביציות. התפתחותם מסומנת על ידי צמיחת תאים וחטיבות עוקבות, שני שלבים קריטיים המכינים את הביצית לאיחוי עם הזרע כדי ליזום אמבריוגנזה. במהלך הגדילה, הביציות מארגנות מחדש את הציטופלסמה שלהן כדי למקם את הגרעין במרכז התא, אירוע המנבא התפתחות מוצלחת של ביציות בעכברים ובבני אדם, ובכך את הפוטנציאל האמבריוגני שלהן. בביציות עכבר, ארגון מחדש ציטופלזמי זה הוכח כמונע על ידי השלד הציטופלזמה, שפעילותו יוצרת כוחות מכניים המתסיסים, ממקמים מחדש וחודרים לגרעין. כתוצאה מכך, העברת כוח ציטופלזמית לנוקלאופלזמית זו מכווננת את הדינמיקה של אברוני עיבוד RNA גרעיניים הידועים כמעבים ביומולקולריים. פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתעד, ברזולוציה טמפורלית גבוהה, את השפעת השלד על הגרעין על פני קני מידה מרחביים בביציות עכבר. הוא מפרט את שלבי ההדמיה וניתוח התמונה והכלים הדרושים כדי להעריך א) פעילות ציטו-שלד בציטופלסמה של הביצית, ii) תסיסה מבוססת שלד של גרעין הביצית, ו-iii) השפעותיה על דינמיקת עיבוי ביומולקולרית בנוקלאופלזמה של הביצית. מעבר לביולוגיה של הביציות, ניתן להתאים את השיטות המתוארות כאן לשימוש בתאים סומטיים כדי לטפל באופן דומה בכוונון מבוסס שלד של דינמיקה גרעינית על פני קני מידה.

Introduction

מיקום גרעיני חיוני עבור פונקציות תאיות והתפתחותיות מרובות 1,2,3,4,5. תאי נבט נקביים של יונקים בשם ביציות מעצבים מחדש את הציטופלסמה שלהם כדי למקם את הגרעין במרכז התא למרות שהם עוברים חלוקה אסימטרית בגודל, אשר מסתמכת על כרומוזום עוקב מחוץ למרכז⁶ (איור 1). מרכוז זה של הגרעין מנבא התפתחות ביציות מוצלחת בעכברים ובבני אדם ^7,8, ולפיכך את הפוטנציאל האמבריוגני שלהן (איור 1).<....

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הקהילה האירופית ואושרו על ידי משרד החקלאות הצרפתי (אישור מס' 75-1170) ועל ידי Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; הסכם GMO מספר DUO-5291). עכברים שוכנו במתקן בעלי החיים במחזור אור / חושך של 12 שעות, עם טמפרטורת סביבה של 22-24 מעלות צלזיוס ולחות של 40%-50%. עכברים המשמ.......

Discussion

השלבים העיקריים בפרוטוקול זה כוללים מיקרו-הזרקה נכונה של ביציות מבלי להשפיע על הישרדותן או על תפקודן התקין ^9,10,11, כמו גם מיקרו-הזרקה של כמויות מוגדרות מראש של cRNA שיאפשרו הדמיה נכונה של מבנים רלוונטיים, כמו כתמים גרעיניים.

קב.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows