Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

Abstract

אתגר מרכזי בהבנת הגורמים לאי פוריות נשית הוא להבהיר מנגנונים השולטים בהתפתחות תאי נבט נקביים, הנקראים ביציות. התפתחותם מסומנת על ידי צמיחת תאים וחטיבות עוקבות, שני שלבים קריטיים המכינים את הביצית לאיחוי עם הזרע כדי ליזום אמבריוגנזה. במהלך הגדילה, הביציות מארגנות מחדש את הציטופלסמה שלהן כדי למקם את הגרעין במרכז התא, אירוע המנבא התפתחות מוצלחת של ביציות בעכברים ובבני אדם, ובכך את הפוטנציאל האמבריוגני שלהן. בביציות עכבר, ארגון מחדש ציטופלזמי זה הוכח כמונע על ידי השלד הציטופלזמה, שפעילותו יוצרת כוחות מכניים המתסיסים, ממקמים מחדש וחודרים לגרעין. כתוצאה מכך, העברת כוח ציטופלזמית לנוקלאופלזמית זו מכווננת את הדינמיקה של אברוני עיבוד RNA גרעיניים הידועים כמעבים ביומולקולריים. פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתעד, ברזולוציה טמפורלית גבוהה, את השפעת השלד על הגרעין על פני קני מידה מרחביים בביציות עכבר. הוא מפרט את שלבי ההדמיה וניתוח התמונה והכלים הדרושים כדי להעריך א) פעילות ציטו-שלד בציטופלסמה של הביצית, ii) תסיסה מבוססת שלד של גרעין הביצית, ו-iii) השפעותיה על דינמיקת עיבוי ביומולקולרית בנוקלאופלזמה של הביצית. מעבר לביולוגיה של הביציות, ניתן להתאים את השיטות המתוארות כאן לשימוש בתאים סומטיים כדי לטפל באופן דומה בכוונון מבוסס שלד של דינמיקה גרעינית על פני קני מידה.

Introduction

מיקום גרעיני חיוני עבור פונקציות תאיות והתפתחותיות מרובות 1,2,3,4,5. תאי נבט נקביים של יונקים בשם ביציות מעצבים מחדש את הציטופלסמה שלהם כדי למקם את הגרעין במרכז התא למרות שהם עוברים חלוקה אסימטרית בגודל, אשר מסתמכת על כרומוזום עוקב מחוץ למרכז6 (איור 1). מרכוז זה של הגרעין מנבא התפתחות ביציות מוצלחת בעכברים ובבני אדם 7,8, ולפיכך את הפוטנציאל האמבריוגני שלהן (איור 1).<....

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הקהילה האירופית ואושרו על ידי משרד החקלאות הצרפתי (אישור מס' 75-1170) ועל ידי Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; הסכם GMO מספר DUO-5291). עכברים שוכנו במתקן בעלי החיים במחזור אור / חושך של 12 שעות, עם טמפרטורת סביבה של 22-24 מעלות צלזיוס ולחות של 40%-50%. עכברים המשמ.......

Representative Results

לוחות תמונה באיור 3 מראים דוגמאות של ביצית טיפוסית שגדלה במלואה (איור 3A), הנוקלאופלזמה בביצית בוגרת במלואה המבטאת YFP-Rango (איור 3B), הנוקלאופלזמה בביצית בוגרת במלואה מבטאת נכונות (פאנל שמאלי; איור 3C) או מוגזם (פאנל ימני;

Discussion

השלבים העיקריים בפרוטוקול זה כוללים מיקרו-הזרקה נכונה של ביציות מבלי להשפיע על הישרדותן או על תפקודן התקין 9,10,11, כמו גם מיקרו-הזרקה של כמויות מוגדרות מראש של cRNA שיאפשרו הדמיה נכונה של מבנים רלוונטיים, כמו כתמים גרעיניים.

קב.......

Acknowledgements

א.א.ג. ומ.א. כתבו במשותף את כתב היד וכל המחברים השותפים העירו על כתב היד. M. A. נתמך על ידי CNRS ו- "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. נתמך על ידי Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel ו- Fondation du Collège de France.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma A3311
CSU-X1-M1 spinning diskYokogawa
DMI6000B microscope Leica
Femtojet microinjectorEppendorf
Fiji
Filter wheelSutter Instruments Roper Scientific
FluorodishWorld Precision InstrumentsFD35-100
Metamorph software Universal Imaging, version 7.7.9.0
Mineral oilSigma AldrichM8410-1L
NanoDrop 2000 Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit Thermo FisherAM1350
Retiga 3 CCD camera QImaging
RNAeasy kit Qiagen74104
SC35 antibodyAbcamab11826Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid  OriGene TechnologiesMG202528NM_011358
Stripper Micropipette XLAB Solutionsspecialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachineThermo FisherAM1384 
T7 mMessage mMachine Thermo FisherAM13344
Thermostatic chamberLife Imaging Service
Windows ExcelWindows

References

  1. Quinlan, M. E. Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte. Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).
  2. Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. A physical perspective on cytoplasmic streaming. Interface Focus. ....

Explore More Articles

JoVE203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved