Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

Summary

Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar o impacto físico do citoesqueleto na forma nuclear e nas organelas sem membrana interna no sistema oócito de camundongos. A estrutura pode ser adaptada para uso em outros tipos de células e contextos.

Abstract

Um grande desafio na compreensão das causas da infertilidade feminina é elucidar os mecanismos que regem o desenvolvimento das células germinativas femininas, denominadas ovócitos. Seu desenvolvimento é marcado pelo crescimento celular e subsequentes divisões, duas fases críticas que preparam o ovócito para a fusão com os espermatozoides para iniciar a embriogênese. Durante o crescimento, os ovócitos reorganizam seu citoplasma para posicionar o núcleo no centro celular, um evento preditivo do sucesso do desenvolvimento oocitário em camundongos e humanos e, portanto, de seu potencial embriogênico. Em ovócitos de camundongos, essa reorganização citoplasmática mostrou-se impulsionada pelo citoesqueleto, cuja atividade gera forças mecânicas que agitam, reposicionam e penetram no núcleo. Consequentemente, essa transmissão de força citoplasmática para nucleoplasmática sintoniza a dinâmica de organelas de processamento de RNA nuclear conhecidas como condensados biomoleculares. Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar, com alta resolução temporal, o impacto do citoesqueleto no núcleo através de escalas espaciais em ovócitos de camundongos. Detalha as etapas e ferramentas de análise de imagem e imagem necessárias para avaliar i) atividade citoesquelética no citoplasma do oócito, ii) agitação do núcleo do oócito baseada no citoesqueleto e iii) seus efeitos na dinâmica do condensado biomolecular no nucleoplasma do oócito. Além da biologia oocitária, os métodos aqui elaborados podem ser adaptados para uso em células somáticas para abordar similarmente a sintonia baseada no citoesqueleto da dinâmica nuclear em escalas.

Introduction

O posicionamento nuclear é essencial para múltiplas funções celulares e de desenvolvimento 1,2,3,4,5. As células germinativas femininas de mamíferos denominadas ovócitos remodelam seu citoplasma para posicionar o núcleo no centro celular, apesar de sofrerem uma divisão assimétrica no tamanho, que depende da descentralização cromossômica⁶ (Figura 1). Essa centralização do núcleo prediz o sucesso do desenvolvimento oocitário em camundongos e humanos

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Comunidade Europeia e aprovados pelo Ministério da Agricultura francês (autorização nº 75-1170) e pela Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; Acordo OGM número DUO-5291). Os camundongos foram alojados no biotério em um ciclo claro/escuro de 12 horas, com temperatura ambiente de 22-24 °C e umidade de 40%-50%. Os camundongos usados aqui incluem fêmeas OF1 (Oncins France 1, 8 a 12 semanas de idade) e fêmeas C5.......

Discussion

As principais etapas desse protocolo incluem a microinjeção adequada de ovócitos sem afetar sua sobrevivência ou função normal ^9,10,11, bem como a microinjeção de quantidades pré-definidas de cRNA que permitiriam a visualização correta de estruturas relevantes, como manchas nucleares.

Estabelecer a ligação entre a dinâmica citoplasmática e a dinâmica (intra)-nuclear é essencial quando.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows