Регистрация ажиотажа ядра ооцита мыши на основе цитоскелета в пространственных масштабах

Summary

Этот протокол обеспечивает экспериментальную основу для документирования физического воздействия цитоскелета на ядерную форму и внутренние безмембранные органеллы в системе ооцитов мыши. Фреймворк может быть адаптирован для использования в других типах ячеек и контекстах.

Abstract

Основной проблемой в понимании причин женского бесплодия является выяснение механизмов, регулирующих развитие женских половых клеток, называемых ооцитами. Их развитие отмечено ростом клеток и последующим делением, двумя критическими фазами, которые подготавливают ооцит к слиянию со сперматозоидом для инициирования эмбриогенеза. Во время роста ооциты реорганизуют свою цитоплазму, чтобы расположить ядро в клеточном центре, что предсказывает успешное развитие ооцитов у мышей и людей и, таким образом, их эмбриогенный потенциал. Показано, что в мышиных ооцитах эта цитоплазматическая перестройка управляется цитоскелетом, деятельность которого порождает механические силы, возбуждающие, перемещающие и проникающие в ядро. Следовательно, эта передача цитоплазматической силы в нуклеоплазматическую настраивает динамику органелл, процессирующих ядерную РНК, известных как биомолекулярные конденсаты. Этот протокол обеспечивает экспериментальную основу для документирования с высоким временным разрешением влияния цитоскелета на ядро в пространственных масштабах в ооцитах мышей. В ней подробно описаны этапы и инструменты визуализации и анализа изображений, необходимые для оценки i) активности цитоскелета в цитоплазме ооцита, ii) возбуждения ядра ооцита на основе цитоскелета и iii) его влияния на динамику биомолекулярного конденсата в нуклеоплазме ооцита. Помимо биологии ооцитов, методы, разработанные здесь, могут быть адаптированы для использования в соматических клетках для аналогичной настройки ядерной динамики на основе цитоскелета в разных масштабах.

Introduction

Ядерное позиционирование имеет важное значение для многих клеточных функций и функций развития 1,2,3,4,5. Женские половые клетки млекопитающих, называемые ооцитами, ремоделируют свою цитоплазму, чтобы расположить ядро в клеточном центре, несмотря на асимметричное деление по размеру, которое зависит от последующего смещения хромосомы⁶ (рис. 1). Такое центрирование ядра предсказывает успешное развитие ооцитов у мышей и человека

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Европейского сообщества и были одобрены Министерством сельского хозяйства Франции (разрешение No 75-1170) и Генеральным управлением исследований и инноваций (DGRI; Номер соглашения о ГМО DUO-5291). Мыши содержали.......

Discussion

Ключевые шаги в этом протоколе включают правильную микроинъекцию ооцитов, не влияющую на их выживание или нормальную функцию ^9,10,11, а также микроинъекции заранее определенных количеств кРНК, которые позволят правильно визуализировать.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows