Análise Qualitativa e Quantitativa da Produção de Siróforos de Pseudomonas aeruginosa

Summary

Este protocolo fornece análises qualitativas e quantitativas de sideróforos totais, pioverdina e piocelina de Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é conhecida por sua produção de diversos fatores de virulência para estabelecer infecções no hospedeiro. Um desses mecanismos é a extração de ferro através da produção de sideróforos. P. aeruginosa produz dois sideróforos diferentes: a pioquelina, que tem menor afinidade quelante ao ferro, e a pioverdina, que tem maior afinidade quelante ao ferro. Este relato demonstra que a pioverdina pode ser quantificada diretamente a partir de sobrenadantes bacterianos, enquanto a pioquelina precisa ser extraída de sobrenadantes antes da quantificação.

O principal método para analisar qualitativamente a produção de sideróforos é o ensaio em placa de ágar Chrome Azurol Sulfonate (CAS). Neste ensaio, a liberação do corante CAS do complexo Fe³⁺-Dye leva a uma mudança de cor de azul para laranja, indicando a produção de sideróforo. Para a quantificação dos sideróforos totais, os sobrenadantes bacterianos foram misturados em proporções iguais com o corante CAS em placa de microtitulação, seguido de análise espectrofotométrica a 630 nm. A pioverdina foi quantificada diretamente a partir do sobrenadante bacteriano, misturando-a em proporções iguais com Tris-HCl 50 mM, seguida de análise espectrofotométrica. Um pico a 380 nm confirmou a presença de pioverdina. Quanto à pioquelina, a quantificação direta do sobrenadante bacteriano não foi possível, por isso teve que ser extraída primeiro. Análises espectrofotométricas subsequentes revelaram a presença de pioquelina, com pico em 313 nm.

Introduction

Os organismos necessitam de ferro para desempenhar várias funções vitais, como o transporte de elétrons e a replicação do DNA¹. Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista Gram-negativo, é conhecida por possuir uma variedade de fatores de virulência para estabelecer infecção no hospedeiro, entre os quais um mecanismo é a formação de sideróforos². Durante as condições de esgotamento do ferro, a P. aeruginosa libera moléculas especializadas chamadas sideróforos, que extinguem o ferro do ambiente circundante. Os sideróforos quelatam o ferro extracelularmente, e o complexo férrico-sideróforo resultante ....

Protocol

Todos os isolados bacterianos de P. aeruginosa foram obtidos de laboratórios de microbiologia médica de Vadodara e Jaipur, Índia. Todos os isolados clínicos selecionados foram manuseados em Gabinete de Biossegurança (BSL2) e o máximo cuidado foi tomado ao manusear isolados bacterianos durante os experimentos. Os detalhes comerciais de todos os reagentes/soluções são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Preparação do corante Cromo Azurol Sulfonato (CAS) e mei.......

Discussion

Este protocolo permite aos pesquisadores quantificar sideróforos totais e dois sideróforos diferentes de P. aeruginosa, a saber, pioverdina e piochelina, a partir do sobrenadante livre de células bacterianas. No ensaio de placas de ágar CAS, o corante CAS e os íons Fe³⁺ formam um complexo. Quando as bactérias produzem sideróforos, elas extinguem íons Fe³⁺ do complexo CAS-Fe³⁺, levando a uma mudança de cor em torno do crescimento bacteriano. Essa alteração resulta em ha.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915