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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo fornece análises qualitativas e quantitativas de sideróforos totais, pioverdina e piocelina de Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é conhecida por sua produção de diversos fatores de virulência para estabelecer infecções no hospedeiro. Um desses mecanismos é a extração de ferro através da produção de sideróforos. P. aeruginosa produz dois sideróforos diferentes: a pioquelina, que tem menor afinidade quelante ao ferro, e a pioverdina, que tem maior afinidade quelante ao ferro. Este relato demonstra que a pioverdina pode ser quantificada diretamente a partir de sobrenadantes bacterianos, enquanto a pioquelina precisa ser extraída de sobrenadantes antes da quantificação.

O principal método para analisar qualitativamente a produção de sideróforos é o ensaio em placa de ágar Chrome Azurol Sulfonate (CAS). Neste ensaio, a liberação do corante CAS do complexo Fe3+-Dye leva a uma mudança de cor de azul para laranja, indicando a produção de sideróforo. Para a quantificação dos sideróforos totais, os sobrenadantes bacterianos foram misturados em proporções iguais com o corante CAS em placa de microtitulação, seguido de análise espectrofotométrica a 630 nm. A pioverdina foi quantificada diretamente a partir do sobrenadante bacteriano, misturando-a em proporções iguais com Tris-HCl 50 mM, seguida de análise espectrofotométrica. Um pico a 380 nm confirmou a presença de pioverdina. Quanto à pioquelina, a quantificação direta do sobrenadante bacteriano não foi possível, por isso teve que ser extraída primeiro. Análises espectrofotométricas subsequentes revelaram a presença de pioquelina, com pico em 313 nm.

Introduction

Os organismos necessitam de ferro para desempenhar várias funções vitais, como o transporte de elétrons e a replicação do DNA1. Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista Gram-negativo, é conhecida por possuir uma variedade de fatores de virulência para estabelecer infecção no hospedeiro, entre os quais um mecanismo é a formação de sideróforos2. Durante as condições de esgotamento do ferro, a P. aeruginosa libera moléculas especializadas chamadas sideróforos, que extinguem o ferro do ambiente circundante. Os sideróforos quelatam o ferro extracelularmente, e o complexo férrico-sideróforo resultante ....

Protocol

Todos os isolados bacterianos de P. aeruginosa foram obtidos de laboratórios de microbiologia médica de Vadodara e Jaipur, Índia. Todos os isolados clínicos selecionados foram manuseados em Gabinete de Biossegurança (BSL2) e o máximo cuidado foi tomado ao manusear isolados bacterianos durante os experimentos. Os detalhes comerciais de todos os reagentes/soluções são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Preparação do corante Cromo Azurol Sulfonato (CAS) e mei.......

Representative Results

Antes da quantificação dos sideróforos dos isolados clínicos, foi realizada uma triagem qualitativa para a produção de sideróforos para garantir a produção de sideróforos. A detecção qualitativa de sideróforos de isolados clínicos foi observada por bactérias em placas de ágar CAS. Três isolados clínicos, MR1, TL7, J3, juntamente com PAO1 (a cepa de referência), foram selecionados para o estudo. Todos os três isolados clínicos e PAO1 apresentaram resultados positivos p.......

Discussion

Este protocolo permite aos pesquisadores quantificar sideróforos totais e dois sideróforos diferentes de P. aeruginosa, a saber, pioverdina e piochelina, a partir do sobrenadante livre de células bacterianas. No ensaio de placas de ágar CAS, o corante CAS e os íons Fe3+ formam um complexo. Quando as bactérias produzem sideróforos, elas extinguem íons Fe3+ do complexo CAS-Fe3+, levando a uma mudança de cor em torno do crescimento bacteriano. Essa alteração resulta em ha.......

Acknowledgements

Os autores agradecem o financiamento do DBT - Programa de Ensino em Biotecnologia, do DBT - Programa BUILDER e do FIST. MR agradece a bolsa recebida da SHODH. HP agradece bolsa recebida da CSIR.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar Agar, Type IHIMEDIAGRM666
8-HydroxyquinolineLoba Chemie4151
Casamino AcidSRL Chemicals68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)HIMEDIARM4867-100G
ChloroformMerck1070242521
Chrome azurol sulfonateHIMEDIARM336-10G
Citric acidMerck100241
Dextrose monohydrateMerck108342
DichloromethaneMerck107020
Ferric chloride hexahydrateHIMEDIAGRM6353
Glass FlasksBorosil5100021
Glass Test-tubesBorosil9820U05
Hydrochloric acidSDFCL20125
King's medium B baseHIMEDIAM1544-500G
M9 Minimal Medium SaltsHIMEDIAG013-500G
Magnesium Sulphate Qualigens10034
MultiskanGO UV SpectrophotometerThermo Scientific51119200
Peptone Type I, BacteriologicalHIMEDIARM667-500G
PIPES free acidMP Biomedicals190257
Potassium dihydrogen phosphateMerck1048731000
Proteose peptoneHIMEDIARM005-500G
Shimadzu UV-Vis SpectrophotometerShimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
Sodium chlorideQualigens15915

References

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Enviro....

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