A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Este protocolo fornece análises qualitativas e quantitativas de sideróforos totais, pioverdina e piocelina de Pseudomonas aeruginosa.
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é conhecida por sua produção de diversos fatores de virulência para estabelecer infecções no hospedeiro. Um desses mecanismos é a extração de ferro através da produção de sideróforos. P. aeruginosa produz dois sideróforos diferentes: a pioquelina, que tem menor afinidade quelante ao ferro, e a pioverdina, que tem maior afinidade quelante ao ferro. Este relato demonstra que a pioverdina pode ser quantificada diretamente a partir de sobrenadantes bacterianos, enquanto a pioquelina precisa ser extraída de sobrenadantes antes da quantificação.
O principal método para analisar qualitativamente a produção de sideróforos é o ensaio em placa de ágar Chrome Azurol Sulfonate (CAS). Neste ensaio, a liberação do corante CAS do complexo Fe3+-Dye leva a uma mudança de cor de azul para laranja, indicando a produção de sideróforo. Para a quantificação dos sideróforos totais, os sobrenadantes bacterianos foram misturados em proporções iguais com o corante CAS em placa de microtitulação, seguido de análise espectrofotométrica a 630 nm. A pioverdina foi quantificada diretamente a partir do sobrenadante bacteriano, misturando-a em proporções iguais com Tris-HCl 50 mM, seguida de análise espectrofotométrica. Um pico a 380 nm confirmou a presença de pioverdina. Quanto à pioquelina, a quantificação direta do sobrenadante bacteriano não foi possível, por isso teve que ser extraída primeiro. Análises espectrofotométricas subsequentes revelaram a presença de pioquelina, com pico em 313 nm.
Os organismos necessitam de ferro para desempenhar várias funções vitais, como o transporte de elétrons e a replicação do DNA1. Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista Gram-negativo, é conhecida por possuir uma variedade de fatores de virulência para estabelecer infecção no hospedeiro, entre os quais um mecanismo é a formação de sideróforos2. Durante as condições de esgotamento do ferro, a P. aeruginosa libera moléculas especializadas chamadas sideróforos, que extinguem o ferro do ambiente circundante. Os sideróforos quelatam o ferro extracelularmente, e o complexo férrico-sideróforo resultante ....
Todos os isolados bacterianos de P. aeruginosa foram obtidos de laboratórios de microbiologia médica de Vadodara e Jaipur, Índia. Todos os isolados clínicos selecionados foram manuseados em Gabinete de Biossegurança (BSL2) e o máximo cuidado foi tomado ao manusear isolados bacterianos durante os experimentos. Os detalhes comerciais de todos os reagentes/soluções são fornecidos na Tabela de Materiais.
1. Preparação do corante Cromo Azurol Sulfonato (CAS) e mei.......
Antes da quantificação dos sideróforos dos isolados clínicos, foi realizada uma triagem qualitativa para a produção de sideróforos para garantir a produção de sideróforos. A detecção qualitativa de sideróforos de isolados clínicos foi observada por bactérias em placas de ágar CAS. Três isolados clínicos, MR1, TL7, J3, juntamente com PAO1 (a cepa de referência), foram selecionados para o estudo. Todos os três isolados clínicos e PAO1 apresentaram resultados positivos p.......
Este protocolo permite aos pesquisadores quantificar sideróforos totais e dois sideróforos diferentes de P. aeruginosa, a saber, pioverdina e piochelina, a partir do sobrenadante livre de células bacterianas. No ensaio de placas de ágar CAS, o corante CAS e os íons Fe3+ formam um complexo. Quando as bactérias produzem sideróforos, elas extinguem íons Fe3+ do complexo CAS-Fe3+, levando a uma mudança de cor em torno do crescimento bacteriano. Essa alteração resulta em ha.......
Os autores agradecem o financiamento do DBT - Programa de Ensino em Biotecnologia, do DBT - Programa BUILDER e do FIST. MR agradece a bolsa recebida da SHODH. HP agradece bolsa recebida da CSIR.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
Chloroform | Merck | 1070242521 | |
Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
Citric acid | Merck | 100241 | |
Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
Dichloromethane | Merck | 107020 | |
Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved