Качественный и количественный анализ продукции сидерофоров синегнойной палочки

Summary

Этот протокол обеспечивает как качественный, так и количественный анализ общего количества сидерофоров, пиовердина и пиохелина синегнойной палочки.

Abstract

Синегнойная палочка (P. aeruginosa) известна тем, что вырабатывает разнообразный спектр факторов вирулентности для установления инфекций в организме хозяина. Одним из таких механизмов является поглощение железа путем производства сидерофоров. P. aeruginosa продуцирует два различных сидерофора: пиохелин, который имеет более низкое железо-хелатное сродство, и пиовердин, который имеет более высокое железо-хелатное сродство. Этот отчет демонстрирует, что пиовердин может быть непосредственно количественно определен из бактериальных надосадочных растворов, в то время как пиохелин должен быть извлечен из надосадочной жидкости перед количественным определением.

Основным методом качественного анализа производства сидерофоров является анализ агаровых пластин на основе хром-азурола сульфоната (CAS). В этом анализе высвобождение красителя CAS из комплекса Fe³⁺-Dye приводит к изменению цвета с синего на оранжевый, что указывает на образование сидерофора. Для количественного определения общего количества сидерофоров бактериальные надосадочные жидкости смешивали в равных пропорциях с красителем CAS в микротитровой пластине с последующим спектрофотометрическим анализом при длине волны 630 нм. Пиовердин определяли непосредственно из бактериальной надосадочной жидкости путем смешивания его в равных пропорциях с 50 мМ Tris-HCl с последующим спектрофотометрическим анализом. Пик на длине волны 380 нм подтвердил наличие пиовердина. Что касается Пиохелина, то прямое количественное определение из бактериальной надосадочной жидкости было невозможно, поэтому его пришлось сначала экстрагировать. Последующий спектрофотометрический анализ выявил присутствие пиохелина с пиком на 313 нм.

Introduction

Организмы нуждаются в железе для выполнения различных жизненно важных функций, таких как перенос электронов и^{репликация ДНК}. Известно, что Pseudomonas aeruginosa, грамотрицательный условно-патогенный патоген, обладает различными факторами вирулентности для установления инфекции в организме хозяина, одним из механизмов которых является образование сидерофора². В условиях истощения железа P. aeruginosa высвобождает специализированные молекулы, называемые сидерофорами, которые гасят железо из окружающей среды. Сидерофоры хелатируют железо внеклеточно, и образующийся железо-сидерофорный комплекс активно тра....

Protocol

Все бактериальные изоляты P. aeruginosa были получены из медицинских микробиологических лабораторий в Вадодаре и Джайпуре, Индия. Все отобранные клинические изоляты обрабатывались в шкафу биобезопасности (BSL2), и во время экспериментов применялась максимальная осторожность при обраще?.......

Discussion

Этот протокол позволяет исследователям количественно определить общее количество сидерофоров и двух различных сидерофоров P. aeruginosa, а именно пиовердина и пиохелина, из бактериальной внеклеточной надосадочной жидкости. В анализе агаровых пластин CAS краситель CAS и ионы Fe³⁺ обр.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915