Primordial kimcellekryopreservering og gjenoppliving av Drosophila-stammer

Summary

En langsiktig konserveringsmetode for Drosophila-stammer som et alternativ til hyppig overføring av voksne fluer til ferske matflasker er svært ønskelig. Denne protokollen beskriver kryopreservering av Drosophila primordiale kimceller og stammegjenoppliving via transplantasjon til agametiske vertsembryoer.

Abstract

Drosophila-stammer må opprettholdes ved hyppig overføring av voksne fluer til nye hetteglass. Dette medfører fare for mutasjonsforringelse og fenotypiske forandringer. Utvikling av en alternativ metode for langtidsbevaring uten slike endringer er derfor avgjørende. Til tross for tidligere vellykkede forsøk, er kryopreservering av Drosophila-embryoer fortsatt ikke av praktisk nytte på grunn av lav reproduserbarhet. Her beskriver vi en protokoll for primordial kimcelle (PGC) kryopreservering og stammegjenoppliving via transplantasjon av kryopreserverte PGC til agametiske Drosophila melanogaster (D. melanogaster) vertsembryoer. PGC er svært gjennomtrengelige for kryobeskyttende midler (CPA), og utviklingsmessig og morfologisk variasjon mellom stammer er mindre problematisk enn ved embryokryopreservering. I denne metoden samles PGC fra ca. 30 donorembryoer, lastes inn i en nål etter CPA-behandling, og deretter kryopreserveres i flytende nitrogen. For å produsere donoravledede kjønnsceller, tines de kryopreserverte PGCene i en nål og deponeres deretter i ca. 15 agametiske vertsembryoer. En frekvens på minst 15% fruktbare fluer ble oppnådd med denne protokollen, og antall avkom per fruktbart par var alltid mer enn nok til å gjenopplive den opprinnelige stammen (gjennomsnittlig avkomstall er 77,2 ± 7,1), noe som indikerer evnen til kryopreserverte PGCer til å bli kimlinjestamceller. Gjennomsnittlig antall fertile fluer per nål var 1,1 ± 0,2, og 9 av 26 nåler produserte to eller flere fruktbare avkom. Det ble funnet at 11 nåler er nok til å produsere 6 eller flere avkom, hvor minst en kvinne og en hann sannsynligvis er inkludert. Den agametiske verten gjør det mulig å gjenopplive stammen raskt ved ganske enkelt å krysse nyoppståtte kvinnelige og mannlige fluer. I tillegg har PGC potensial til å bli brukt i genteknologiske applikasjoner, for eksempel genomredigering.

Introduction

Vedlikehold av Drosophila-stammer ved overføring av voksne fluer til nye matflasker resulterer uunngåelig i akkumulering av mutasjoner og epigenetiske endringer over tid. Utvikling av en alternativ metode for langsiktig vedlikehold av Drosophila-stammer uten slike endringer er avgjørende, spesielt for referansestammer der hele genomet må opprettholdes. Flere vellykkede forsøk på å kryobevare Drosophila-embryoer eller eggstokker har blitt beskrevet ^1,2,3. Dessverre er de fortsatt ikke av praktisk bruk på grunn av lav reproduserbarhet. Faktisk har embryoer i tidlig stadium en lav overlevelsesrate etter kryopreservering på grunn av deres høye eggeplommeinnhold, noe som hindrer kryobeskyttende middel (CPA) permeasjon og diffusjon ^2,3. CPA permeabilitet er også sterkt begrenset av voksagtige lag av sent stadium embryoer. Det er vanskelig og tidkrevende å finne en stammespesifikk tidsperiode der embryoer har høy overlevelse og et tynnere vokslag. Nylig forbedret Zhan et ^al.4 metoder for embryopermeabilisering, CPA-belastning og vitrifikasjon og vellykket kryopreserverte embryoer av flere stammer. Metodene er imidlertid ikke enkle å anvende fordi levedyktigheten til embryoer etter permeabilisering har en tendens til å være dårlig. Derfor er det fortsatt behov for ytterligere forbedring og utvikling av alternative tilnærminger. Metoder som involverer kryopreservering av primordiale kimceller (PGC) er en alternativ tilnærming for langsiktig vedlikehold av Drosophila-stammer.

PGC (også kalt polcelle) transplantasjon har blitt brukt til å generere germline kimærer, spesielt kvinner, for å studere prosesser som mors effekter av zygotiske dødelige mutasjoner og kjønnsbestemmelse av kjønnsceller 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGC er mye mindre enn embryoer og vil sannsynligvis være svært gjennomtrengelig for de fleste kryobeskyttelsesmidler. Videre er utviklingsmessig og morfologisk variasjon mellom stammer mindre problematisk, og en agametisk vert muliggjør rask restaurering av hele genomer. Vi har nylig utviklet en ny metode for PGC kryopreservering¹³, som forhindrer de ellers uunngåelige genetiske og epigenetiske endringene i Drosophila-stammer. Her presenterer vi den detaljerte protokollen.

Denne kryopreserveringsmetoden krever spesifikk ekspertise innen PGC-håndtering og instrumentering. Mens en trinnvis tilnærming kan være en effektiv løsning for de som ikke er kjent med det, kan det være uegnet for små laboratorier på grunn av instrumenteringskrav. Denne PGC-kryopreserveringsprotokollen kan lettere tilpasses for bruk med forskjellige Drosophila-arter og forskjellige insektarter enn embryokryopreserveringsprotokoller på grunn av mindre utviklingsmessige og morfologiske forskjeller. PGC kan også potensielt brukes i genteknologiske applikasjoner, for eksempel genomredigering 14,15,16. Oppsummert kan denne metoden brukes i lagersentre og andre laboratorier for å opprettholde flue- og andre insektstammer i lengre perioder uten endringer.

Protocol

1. Forberedelse av utstyr

1. Mikromanipulatorsystem: Sett sammen et mikromanipulatorsystem for å samle inn og transplantere celler (figur 1A).
2. PGC-samling glassglass (figur 2A)
   1. For å forberede heptanlim, kutt ca. 30 cm lang dobbeltsidig tape og suge den over natten i 7 ml teknisk (vanlig) heptanoppløsning.
   2. Tegn to parallelle referanselinjer for embryojustering på baksiden av et glassglass.
   3. Spred dråper av ovennevnte heptan lim på glassglasset (på siden uten linjene) ved hjelp av en Pasteur-pipette. Lufttørk overflaten på lysbildet til det blir hvitt.
   4. Gjenta tilsetning og spredning av heptan-limdråper og tørk lysbildet igjen.
      MERK: Limet hindrer flytende løsninger i å spre seg over den flate overflaten og gjør det lettere å legge vandige løsninger i en nål.
   5. For å lage embryo-pool-rammer, fest tre lag med 0,2 mm tykk standard vinyltape, for eksempel elektrisk tape, på et skjærebrett. Klipp båndet i 1,5 cm brede rektangler. Klipp deretter bort alle tre lagene med tape, og la en ramme på 2 til 3 mm.
      MERK: En embryo-pool ramme er festet etter justering av embryoer, for å danne et basseng for embryoer.
3. Transplantasjon nåler
   MERK: Alle kommersielt tilgjengelige nåler på tidspunktet for denne studien var for smale eller for brede for PGC-kryopreservering.
   1. Lag en nål ved hjelp av en glasskapillær og en trekker. Vi bruker en NARISHIGE PN-31 trekker med varmeapparatnivået på 85,0-98,4, magnetens hovednivå på 57,8 og magnetens undernivå på 45,0.
   2. For å lage en nål med en omtrentlig veggtykkelse på 1 μm og en spiss på ca. 200 μm med en indre diameter på 10-12 μm, polerer du nålespissen i den følgende tretrinnsprosessen (figur 3). Først slipes nålespissen i en vinkel på 30° med en hastighet på 780 o/min til spissen har en indre diameter på 10-12 μm. Dette første slipetrinnet tar omtrent 1 time.
      MERK: For å unngå å knekke nålespissen, roter først slipesteinen og flytt deretter kanylen forsiktig ned på slipesteinen.
   3. Tegn en strek på toppen av nålen for å følge ønsket vinkel. Drei nålen mot klokken ved 90° og poler den igjen med en hastighet på 180 o / min. Dette tar ca. 5 min.
   4. Roter nålen 45° med klokken og poler den med en hastighet på 180 o / min i ett sekund.
   5. Plasser et oppsamlingsglassglass med en dråpe kromsyreblanding (FORSIKTIG: giftig) på mikroskopstadiet. Fest kanylen til kapillærholderen (figur 1D) i en vinkel på 10°-13° i forhold til glideflaten, flytt kanylen forsiktig ned og senk spissen ned i kromsyreblandingen.
   6. Ved å trekke og skyve stempelet (figur 1B), må oppløsningen mekanisk lastes inn og tømmes fra nålen flere ganger for å fjerne glassrester i nålen. Pass på å rengjøre ytterveggen også.
   7. Vask innsiden og utsiden av nålen to ganger med destillert vann for å fjerne kromsyren helt.

2. Innsamling og kryopreservering av PGC

1. Samler embryoer
   1. Overfør et passende antall fluer av donorstammen av interesse (ca. 450 for hvert kjønn for embryoinnsamlingskoppen) til et embryooppsamlingskopp med en embryooppsamlingsplate (figur 1E) og inkuber dem ved 25 °C. Vi bruker vanligvis 3 til 5 dager gamle foreldrefluer som er oppdrettet under mindre overfylte forhold ved romtemperatur (23-25 ° C).
   2. Utfør to 30-minutters forsamlinger og kast eventuelle egg som er lagt. Fordi kvinner kan beholde befruktede egg som utvikler seg i ovidukten, er dette trinnet nødvendig for å synkronisere egglegging i trinn 2.1.3 (figur 4).
   3. Etter de to forinnsamlingene, samle embryoer i 50 minutter og inkuber deretter de innsamlede embryoene i et fuktet kammer ved 25 °C for å la embryoene utvikle seg til blastodermstadiet (tidlig stadium 5¹⁷). Inkubasjonstiden er vanligvis 100 min, men kan forlenges opptil 120 min, avhengig av belastningen (figur 4).
      NOTAT: Et fuktet kammer lages ved å plassere et fuktig papirhåndkle i bunnen av en plastboks og spraye det med en tåke av vann før bruk. I tidlige stadium-5 embryoer er PGC-dannelsen fullført, men somatisk cellularisering er det ikke. Det nøyaktige stadiet av et embryo bestemmes under et sammensatt mikroskop i trinn 2.4.
2. Dehorionerende embryoer
   1. Sett inn en dråpe destillert vann på en nettsil i rustfritt stål (150 mesh, 109 μm åpning, 60 μm ledningsdiameter; Figur 1F). Bruk tang, samle embryoer fra embryo-samlingsplaten og legg dem i vanndråpen.
   2. Trykk silkepapir mot silen fra undersiden for å absorbere vannet. Tilsett dråper med fersk 5% (som Cl) natriumhypoklorittoppløsning til embryoene og bank kontinuerlig på silen i 10 s.
   3. Vask embryoene ved å sprute dem direkte med destillert vann og trykk silkepapir mot silen fra undersiden for å absorbere vannet. Gjenta dette trinn 3x.
3. Justering av dekorionerte embryoer
   1. Under et stereomikroskop, bruk tang for å overføre embryoer. Juster de dekorionerte embryoene i to rader på et PGC-samlingsglassglass langs de to referanselinjene (figur 2A). Embryoene er orientert med fremre høyre (siden som skal manipuleres) og ventral side opp.
      MERK: Dette trinnet skal være ferdig på 20 minutter, hvor vi vanligvis justerer omtrent 40 embryoer.
   2. Fest en embryo-pool ramme rundt embryoene på PGC-samlingen glass lysbilde. Dropp 1 μL CPA-løsning (1x Ephrussi-Beadle Ringer-løsning, EBR, inneholdende 20% etylenglykol og 1 M sukrose; 1x EBR: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂ og 10 mM Hepes ved pH 6,9) på to separate steder i området omsluttet av rammen og fyll bassenget med silikonolje for å forhindre at embryoene tørker ut (figur 2A).
      MERK: For å klargjøre CPA-oppløsningen, oppløs fullstendig 10,26 g sukrose i ca. 20 ml destillert_H2O, inneholdende 3 ml 10 x EBR-oppløsning. Tilsett 6 ml etylenglykol og tilsett deretter destillert_H2Oopp til 30 ml. Etter grundig blanding, filtrer løsningen gjennom en 0,22 mm engangsmembran.
4. Innsamling av PGC
   1. Plasser PGC-samlingsglassglasset i trinn 2.3.2 på scenen i et mikroskop utstyrt med et mikromanipulatorsystem. Fest kanylen til kapillærholderen og bring det første embryoet i venstre rad og nålespissen inn i samme fokalplan. Legg silikonolje i nålen i 2-3 s.
   2. Begynn PGC-innsamling fra embryoer i venstre rad. Bruk en 20x objektivlinse, flytt forsiktig nålespissen til overflaten av den fremre enden av embryoet og penetrer embryoet mot den bakre enden, ikke ved å bevege nålen, men ved å bevege mikroskoptrinnet.
   3. Når nålespissen når den bakre enden, trekkes nålen litt inn og tømmes helt eventuell eggeplomme i nålen like innenfor det somatiske cellelaget.
   4. Mens du holder trykket i nålen konstant, flytt nålespissen til PGCene like innenfor den bakre polen og forsiktig, men uten å ta mye tid, belast PGC-ene.
   5. Trekk nålen raskt ut av embryoet og tøm eggeplomme og andre forurensninger fra nålen inn i silikonoljebassenget, og hold PGCene i nålen. Legg deretter ren silikonolje fra bassenget.
   6. Gjenta trinn 2.4.2 til 2.4.5 for de andre embryoene i venstre rad. Før du samler PGC fra et nytt embryo, deponer så mye av silikonoljen som er lastet i trinn 2.4.5 inne i det somatiske cellelaget som mulig, mens du holder belastede PGC i nålen. Dette sikrer at nylastede PGC-er ligger ved siden av de tidligere innsamlede PGC-ene uten noe mellomliggende materiale mellom dem.
   7. Etter å ha fullført PGC-innsamling fra embryoer i venstre rad, skille PGC fra eggeplommen og andre forurensninger så mye som mulig. For å oppnå dette, deponer alle PGC i nålen på overflaten av et embryo og fjern eventuelle eggeplommer eller andre forurensninger til et annet nærliggende embryo.
   8. Deretter samler du PGC fra embryoer i høyre rad. Kombiner PGCene samlet fra høyre og venstre rad.
5. Påføring av kryobeskyttelsesmiddel (CPA) på PGC
   1. Etter å ha vasket nålen med CPA i en dråpe, legg fersk CPA i en annen dråpe inn i nålen og legg CPA til PGCene som er avsatt på embryoet. Volumet av CPA skal være tilsvarende PGC-ene.
   2. Fjern så mye CPA som mulig fra klyngen av PGC 1-2 s etter tillegg av CPA. PGC krymper litt og blir firkantet i form umiddelbart etter CPA-tillegg.
   3. Tøm nålen og sett silikonolje i 5 sekunder eller lenger. Legg i alle innsamlede PGC-er og legg deretter silikonolje igjen i 5 s eller lenger. PGC er nå klemt mellom to lag silikonolje (figur 2B).
      MERK: Det er viktig å fjerne så mye eggeplomme, CPA og andre forurensninger som mulig.
6. Kryopreserverende PGC
   1. Åpne treveis stoppekran (figur 1C) og løsne deretter nålen fra mikromanipulatoren. Blett oljen av overflaten av nålen med mykt silkepapir. Ikke berør spissen av nålen direkte med vevet.
   2. Fest kanylen til en kanyleholder og lås den på plass ved foten med vinyltape (figur 1H). Fest en etikett på holderrøret.
   3. Blitsfrys holderen med kanylen pekende nedover ved å senke den i flytende nitrogen. Ikke slipp holderen før væsken slutter å bruse ut av stativet.
   4. Oppbevar holderen i en lagringstank for flytende nitrogen i væskefaseområdet, ikke dampfaseområdet.

3. Tining og transplantasjon av PGC

1. Innsamling, dekorionering og justering av embryoer fra agametiske vertsfluer
   1. Samle og dekorere embryoer fra agametiske vertsfluer etter trinn 2.
   2. Juster stadium 5 agametiske vertsembryoer på et transplantasjonsglassglass. Men denne gangen orienterer du bakre til høyre (siden som skal manipuleres) og ventral til toppen (figur 5). Still opp ca 30 embryoer i to rader på 20 minutter.
   3. Mens du justerer embryoer, bruk en luftfukter i 2-10 minutter hvis fuktigheten i rommet krever det (tabell 1). Den ideelle fuktigheten er 30% til 40%, men dette kan variere avhengig av termiske forhold.
2. Tining og transplantasjon av PGC i vertsembryoer
   1. For raskt å tine kryopreserverte PGC, sett holderen som inneholder nålen inn i romtemperatur 1x EBR-oppløsning med nålen pekende nedover og hold den nedsenket i 10 sekunder.
   2. Plasser transplantasjonsglassglasset på scenen av et mikroskop. Fest den frysetinte kanylen til kapillærholderen og før det første embryoet i venstre rad og nålespissen inn i samme fokalplan.
   3. Bruk en 20x objektivlinse, beveg nålespissen forsiktig til overflaten av den bakre enden av embryoet.
   4. Forsiktig prod utsiden av hvert embryo og sørg for at de sakte går tilbake til sin opprinnelige form. Proddingen vil bekrefte at embryoets indre trykk ikke er for høyt eller for lavt.
   5. Beveg nålen forsiktig og penetrer et embryo fra den bakre polen.
   6. Legg forsiktig ca. 10-20 PGC rett innenfor den bakre polen, nøyaktig mellom vitellinemembranen og det somatiske cellelaget i embryoet. Unngå å deponere dem i det somatiske cellelaget. Hvis perivitellinvæsken lekker ut av embryoet, sug den lekkede væsken inn i nålen og fjern den.
   7. Trekk nålen tilbake fra embryoet. Gjenta trinn 3.2.5 og 3.2.6 for påfølgende embryoer.

4. Inkubere embryoer og gjenopprette donorstammer

1. Fjern eventuelle embryoer som ikke mottar transplantert PGC og inkuber de gjenværende embryoene i et fuktet kammer (figur 1G) ved 25 °C.
2. Ved 24 timer eller mer etter transplantasjon og så snart som mulig etter klekking, bruk tang for å plukke opp og overføre klekkede larver til standard Drosophila matflasker og ruge ved 25 °C.
3. For å gjenopplive stammen, kryss nylig oppståtte kvinner og hanner (figur 6).
   MERK: Agametiske verter gjør det mulig å gjenopprette hele genomet på en gang uten å krysse til balanser-kromosomstammer. Sameksistensen av agametiske hanner i et hetteglass vil ikke ha noe å si fordi hunner, selv om de parres med dem, ikke viser langsiktige responser etter parring, inkludert redusert mottakelighet for å omgjøre ^18,19.

Discussion

En kritisk faktor for suksess i PGC kryopreservering og vekkelse er å bruke gode embryoer. Unge hunner (f.eks. 3 til 5 dager gamle) bør brukes til embryoinnsamling. Både donor- og vertsembryoer vurderes ved mikroskopisk inspeksjon, og bare de på blastodermstadiet (trinn 5) brukes¹². For PGC-innsamling justerer vi vanligvis ca. 40 donorembryoer i løpet av en periode på 20 minutter og samler PGC fra ca. 30 embryoer tidlig i fase 5; Eldre og defekte embryoer brukes ikke. Etter kryopreservering og tining bør PGC opprettholde sin form; PGC-brudd ved mislykket konservering. Vertsembryoer bør også være på stadium 5 og ha et moderat indre trykk; Embryoer bør sakte gå tilbake til sin opprinnelige form etter mild prodding. Altfor og utilstrekkelig tørkede embryoer vil ikke utvikle seg normalt etter transplantasjon. Fordi heteroseksuell transplantasjon av PGC ikke klarer å produsere kjønnsceller i Drosophila ^5,10, er transplantasjon av PGC fra flere donorembryoer til vertsembryoer mer sannsynlig å gi fruktbare voksne. For dette formål samler vi vanligvis PGC fra omtrent 30 embryoer per nål.

Som kryobeskyttelsesmidler prøvde vi etylenglykol, dimetylsulfoksid og glyserol sammen med sukrose i forskjellige konsentrasjoner. Vi bestemte at EBR inneholdende 20% etylenglykol og 1 M sukrose var den beste¹³; Bruk av forskjellige kryobeskyttelsesmidler kan imidlertid forbedre PGC-bevaring²².

Denne kryopreserveringsmetoden krever spesialiserte ferdigheter innen PGC-håndtering, og omtrent 6 ukers trening er nødvendig for å samle og transplantere PGC komfortabelt. For å vurdere og forbedre ferdighetsferdighetene, kan dette deles inn i seks treningstrinn: 1) justere embryoer på et glassglass, 2) kontrollere en manipulator, 3) transplantere PGC fra et embryo til et annet embryo uten kryopreservering, 4) transplantere PGC fra 10 eller flere embryoer til 5 til 10 embryoer, 5) transplantere PGC etter påføring av CPA, og 6) transplantere PGC etter frysetining. Hvert trinn kan ta 1 uke. De kortsiktige målene i trinn 3 er en klekkefrekvens på 40%, levedyktighet fra embryo til voksen på 10%-20%, og en frekvens av fertile fluer på 20%.

PGC-kryopreservering krever kostbar instrumentering og høyt kvalifisert personell. Derfor kan denne metoden ikke vedtas av mange laboratorier. Den nåværende PGC-metoden har imidlertid flere viktige aspekter. For det første er PGC mye mindre enn embryoer og er svært gjennomtrengelige for kryobeskyttelsesmidler. I motsetning til dette er kryobeskyttelsesmiddelpermeabiliteten sterkt begrenset av de voksagtige lagene av Drosophila-embryoer, som er det alvorligste problemet ved embryokryopreservering. Faktisk har tidligere studier gjort store anstrengelser for å finne et tidsvindu der embryoer har høy overlevelse og et tynnere vokslag. Den andre er opptatt av utviklingsmessig og morfologisk variasjon mellom stammer. PGC samles fra tidlige stadium-5 embryoer (2 t 30 min-3 t 20 min etter egglegging), mens embryokryopreservering utføres på stadium-16 embryoer (14-22 timer etter egglegging). Embryoene er derfor mye eldre og viser mye større belastningsvariasjon i det optimale tidsvinduet for kryopreservering sammenlignet med PGC-kryopreservering. Faktisk varierte frekvensen av verter som produserte donoravledet avkom ikke mellom fem stammer studert av Asaoka et ^al.13, selv om vertene ikke var agametisk. Videre har PGC potensial til å bli brukt i genteknologiske applikasjoner, for eksempel genomredigering 14,15,16.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	017-00256	For embryo collection
Agar powder	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	010-08725	For embryo collection
Calcium chloride	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	038-24985	For EBR solution
Capillary	Sutter Instrument	B100-75-10-PT	BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs
Capillary holder	Eppendorf	5196 081.005	Capillary holder 4; for micromanipulation
Chromic acid mixture	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	037-05415	For needle washing
CPA solution			1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose
Double-sided tape	3M	Scotch w-12	For glue extracting
Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR)			130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9
Ethanol (99.5)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	057-00451	For embryo collection
Ethylene glycol	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	054-00983	For CPA solution
Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish	Corning Inc.	351006	For embryo collection
Forceps	Vigor	Type5 Titan	For embryo handling
Grape juice	Asahi Soft Drinks Co., LTD.	Welch's Grape 100	For embryo collection
Grape juice agar plate			50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid
Heptane	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	084-08105	For glue extracting
Humidifier	APIX INTERNATIONAL CO., LTD.	FSWD2201-WH	For embryo preparation
Inverted microscope	Leica Microsystems GmbH	Leica DM IL LED	For micromanipulation
Luer-lock glass syringe	Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.	0550 14 71 08	Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation
Mechanical micromanipulator	Leica Microsystems GmbH		For micromanipulation
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind., Ltd.	S-2441	For embryo aligning
Microgrinder	NARISHIGE Group	Custom order	EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation
Microscope camera	Leica Microsystems GmbH	Leica MC170 HD	For micromanipulation
Needle holder	Merck KGaA	Eppendorf TransferTip (ES)	For cryopreservation
Potassium chloride	Nacalai Tesque, Inc.	28514-75	For EBR solution
Puller	NARISHIGE Group	PN-31	For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0.
PVC adhesive tape for electric insulation	Nitto Denko Corporation	J2515	For embryo-pool frame
Silicon oil	Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd.	FL-100-450CS	For embryo handling
Sodium chloride	Nacalai Tesque, Inc.	31320-05	For EBR solution
Sodium hypochlorite solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	197-02206	Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching
Sucrose	Nacalai Tesque, Inc.	30404-45	For CPA solution