Primordial kimcelle kryopræservering og genoplivning af Drosophila stammer

Summary

En langsigtet konserveringsmetode for Drosophila-stammer som et alternativ til hyppig overførsel af voksne fluer til hætteglas med friske fødevarer er meget ønskelig. Denne protokol beskriver kryopræservering af Drosophila primordiale kimceller og stamme genoplivning via deres transplantation til agametiske værtsembryoner.

Abstract

Drosophila-stammer skal opretholdes ved hyppig overførsel af voksne fluer til nye hætteglas. Dette medfører en fare for mutationsforringelse og fænotypiske ændringer. Det er derfor bydende nødvendigt at udvikle en alternativ metode til langtidsbevaring uden sådanne ændringer. På trods af tidligere vellykkede forsøg er kryopræservering af Drosophila-embryoner stadig ikke til praktisk brug på grund af lav reproducerbarhed. Her beskriver vi en protokol for kryopræservering af primordiale kimceller (PGC) og genoplivning af stammer via transplantation af kryopræserverede PGC'er til agametiske Drosophila melanogaster (D. melanogaster) værtsembryoner. PGC'er er meget gennemtrængelige for kryoprotektive midler (CPA'er), og udviklingsmæssig og morfologisk variation blandt stammer er mindre problematisk end ved embryokryopræservering. I denne metode opsamles PGC'er fra ca. 30 donorembryoner, lægges i en nål efter CPA-behandling og kryopræserveres derefter i flydende nitrogen. For at producere donorafledte kønsceller optøs de kryopræserverede PGC'er i en nål og deponeres derefter i ca. 15 agametiske værtsembryoner. En frekvens på mindst 15% frugtbare fluer blev opnået med denne protokol, og antallet af afkom pr. frugtbart par var altid mere end nok til at genoplive den oprindelige stamme (det gennemsnitlige afkomstal var 77,2 ± 7,1), hvilket indikerer kryopræserverede PGC'ers evne til at blive kimlinjestamceller. Det gennemsnitlige antal fertile fluer pr. nål var 1,1 ± 0,2, og 9 ud af 26 nåle producerede to eller flere frugtbare afkom. Det blev konstateret, at 11 nåle er nok til at producere 6 eller flere afkom, hvor mindst en hun og en mand sandsynligvis er inkluderet. Den agametiske vært gør det muligt at genoplive stammen hurtigt ved blot at krydse nyopståede kvindelige og mandlige fluer. Derudover har PGC'er potentiale til at blive brugt i genteknologiske applikationer, såsom genomredigering.

Introduction

Vedligeholdelsen af Drosophila-stammer ved overførsel af voksne fluer til nye hætteglas resulterer uundgåeligt i akkumulering af mutationer og epigenetiske ændringer over tid. Udvikling af en alternativ metode til langsigtet vedligeholdelse af Drosophila-stammer uden sådanne ændringer er bydende nødvendig, især for referencestammer, hvor hele genomet skal opretholdes. Flere vellykkede forsøg på at kryopræservere Drosophila-embryoner eller æggestokke er blevet beskrevet ^1,2,3. Desværre er de stadig ikke til praktisk brug på grund af lav reproducerbarhed. Faktisk har embryoner i tidlige stadier en lav overlevelsesrate efter kryopræservering på grund af deres høje indhold af æggeblommer, hvilket hæmmer gennemtrængning og diffusion af kryoprotektive midler (CPA) ^2,3. CPA-permeabiliteten er også stærkt begrænset af de voksagtige lag af embryoner i sene stadier. Det er vanskeligt og tidskrævende at finde en stammespecifik tidsperiode, hvor embryoner har en høj overlevelsesrate og et tyndere vokslag. For nylig forbedrede Zhan et ^al.4 metoder til embryopermeabilisering, CPA-belastning og vitrifikation og med succes kryopræserverede embryoner af flere stammer. Metoderne er imidlertid ikke lette at anvende, fordi embryonernes levedygtighed efter permeabilisering har tendens til at være dårlig. Der er derfor stadig behov for yderligere forbedring og udvikling af alternative tilgange. Metoder, der involverer kryopræservering af primordiale kimceller (PGC'er), er en alternativ tilgang til langsigtet vedligeholdelse af Drosophila-stammer.

PGC (også kaldet polcelle) transplantation er blevet brugt til at generere kimlinjekimærer, især kvinder, til at studere processer som moderens virkninger af zygotiske dødelige mutationer og kønsbestemmelse af kimceller 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGC'er er meget mindre end embryoner og vil sandsynligvis være meget gennemtrængelige for de fleste kryoprotektorer. Desuden er udviklingsmæssig og morfologisk variation blandt stammer mindre problematisk, og en agametisk vært muliggør hurtig gendannelse af hele genomer. Vi har for nylig udviklet en ny metode til PGC kryopræservering¹³, som forhindrer de ellers uundgåelige genetiske og epigenetiske ændringer i Drosophila-stammer. Her præsenterer vi den detaljerede protokol.

Denne kryopræserveringsmetode kræver særlig ekspertise inden for PGC-håndtering og instrumentering. Mens en trinvis tilgang kan være en effektiv løsning for dem, der ikke er bekendt med det, kan det være uegnet til små laboratorier på grund af instrumenteringskrav. Denne PGC-kryopræserveringsprotokol kan lettere tilpasses til brug med forskellige Drosophila-arter og forskellige insektarter end embryokryopræserveringsprotokoller på grund af mindre udviklingsmæssige og morfologiske forskelle. PGC'er kan også potentielt bruges i genteknologiske applikationer, såsom genomredigering 14,15,16. Sammenfattende kan denne metode bruges i lagercentre og andre laboratorier til at opretholde flue og andre insektstammer i længere perioder uden ændringer.

Protocol

1. Forberedelse af udstyr

1. Mikromanipulatorsystem: Saml et mikromanipulatorsystem til indsamling og transplantation af celler (figur 1A).
2. PGC-samling glasglas (figur 2A)
   1. For at forberede heptanlim skæres ca. 30 cm lang dobbeltklæbende tape og lægges i blød natten over i 7 ml teknisk (almindelig) heptanopløsning.
   2. Tegn to parallelle referencelinjer for embryojustering på bagsiden af et glasglas.
   3. Spred dråber af ovennævnte heptanlim på glasobjektglasset (på siden uden linjerne) ved hjælp af en Pasteur-pipette. Lufttør overfladen af diaset, indtil den bliver hvid.
   4. Gentag tilsætningen og spredningen af heptan-limdråber og tør diaset igen.
      BEMÆRK: Limen forhindrer flydende opløsninger i at sprede sig over den flade overflade og gør det lettere at lægge vandige opløsninger i en nål.
   5. For at lave embryopoolrammer skal du klæbe tre lag 0,2 mm tykt standard vinylbånd, såsom elektrisk tape, på et skærebræt. Skær båndet i 1,5 cm brede rektangler. Skær derefter alle tre lag tape væk, så der efterlades en ramme på 2 til 3 mm.
      BEMÆRK: En embryopoolramme anbringes efter justering af embryoner for at danne en pulje til embryoner.
3. Transplantation nåle
   BEMÆRK: Alle kommercielt tilgængelige nåle på tidspunktet for denne undersøgelse var for smalle eller for brede til PGC-kryopræservering.
   1. Lav en nål ved hjælp af en glaskapillær og en aftrækker. Vi bruger en NARISHIGE PN-31 aftrækker med varmelegemet på 85,0-98,4, magnethovedniveauet på 57,8 og magnetunderniveauet på 45,0.
   2. For at fremstille en nål med en omtrentlig vægtykkelse på 1 μm og en spids på ca. 200 μm i længden med en indvendig diameter på 10-12 μm poleres nålespidsen i følgende tretrinsproces (figur 3). Slib først nålespidsen ned i en vinkel på 30° med en hastighed på 780 o/min, indtil spidsen har en indvendig diameter på 10-12 μm. Dette første slibetrin tager ca. 1 time.
      BEMÆRK: For at undgå at knække nålespidsen skal du først dreje slibestenen og derefter forsigtigt flytte nålen ned på slibestenen.
   3. Tegn en linje på toppen af nålen for at spore den ønskede vinkel. Drej nålen mod uret ved 90° og polér den igen med en hastighed på 180 omdr./min. Dette tager ca. 5 min.
   4. Drej nålen 45° med uret og polér den med en hastighed på 180 o/min i et sekund.
   5. Anbring et opsamlingsglasglas med en dråbe kromsyreblanding (FORSIGTIG: giftig) på mikroskopstadiet. Sæt nålen på kapillærholderen (figur 1D) i en vinkel på 10°-13° i forhold til glidefladen, flyt forsigtigt nålen ned, og nedsænk spidsen i kromsyreblandingen.
   6. Ved at trække og skubbe stemplet (figur 1B) påføres og aflades opløsningen mekanisk flere gange for at fjerne glasrester i nålen. Sørg også for at rengøre ydervæggen.
   7. Vask kanylens inderside og yderside to gange med destilleret vand for at fjerne kromsyren helt.

2. Indsamling og kryopræservering af PGC'er

1. Indsamling af embryoner
   1. Et passende antal fluer af den pågældende donorstamme (ca. 450 for hvert køn for embryonopsamlingsbægeret) overføres til et embryonopsamlingsbæger med en embryonopsamlingsplade (figur 1E) og inkuberes ved 25 °C. Vi bruger normalt 3 til 5 dage gamle forældrefluer, der opdrættes under mindre overfyldte forhold ved stuetemperatur (23-25 °C).
   2. Udfør to 30-minutters forsamlinger, og kassér eventuelle æg, der er lagt. Fordi kvinder kan beholde befrugtede æg, der udvikler sig i ovidukten, er dette trin nødvendigt for at synkronisere æglægning i trin 2.1.3 (figur 4).
   3. Efter de to forindsamlinger opsamles embryonerne i 50 minutter og inkuberes derefter de indsamlede embryoner i et befugtet kammer ved 25 °C, således at embryonerne kan udvikle sig til blastoderm-stadiet (tidligt stadium^5-17). Inkubationstiden er normalt 100 minutter, men kan forlænges op til 120 minutter afhængigt af stammen (figur 4).
      BEMÆRK: Et befugtet kammer fremstilles ved at placere et fugtigt køkkenrulle i bunden af en plastikkasse og sprøjte det med en tåge vand før brug. I embryoner i tidlig fase 5 er PGC-dannelsen komplet, men somatisk cellularisering er det ikke. Det nøjagtige stadium af et embryo bestemmes under et sammensat mikroskop i trin 2.4.
2. Dechorionerende embryoner
   1. Afsæt en dråbe destilleret vand på en netsil i rustfrit stål (150 mesh, 109 μm åbning, 60 μm tråddiameter; Figur 1F). Brug tang til at samle embryoner fra embryoopsamlingspladen og læg dem i vanddråben.
   2. Tryk silkepapir mod sien nedefra for at absorbere vandet. Tilsæt dråber frisk 5% (som Cl) natriumhypochloritopløsning til embryonerne og tryk kontinuerligt på silen i 10 sekunder.
   3. Vask embryonerne ved at sprøjte dem direkte med destilleret vand og tryk silkepapir mod sien nedenunder for at absorbere vandet. Gentag dette trin 3x.
3. Tilpasning af dechorionerede embryoner
   1. Brug tang under et stereomikroskop til at overføre embryoner. De dechorionerede embryoner justeres i to rækker på et PGC-opsamlingsglasglas langs de to referencelinjer (figur 2A). Embryonerne er orienteret med deres forreste til højre (den side, der skal manipuleres) og ventral side opad.
      BEMÆRK: Dette trin skal være afsluttet på 20 minutter, hvor vi normalt justerer ca. 40 embryoner.
   2. Anbring en embryopoolramme omkring embryonerne på PGC-opsamlingsglasrutschebanen. Der afleveres 1 μL CPA-opløsning (1x Ephrussi-Beadle Ringer-opløsning, EBR, indeholdende 20 % ethylenglycol og 1 M saccharose; 1x EBR: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM_CaCl2 og 10 mM Hepes ved pH 6,9) to separate steder i det område, som rammen omslutter, og poolen fyldes med silikoneolie for at forhindre, at embryonerne tørrer ud (figur 2A).
      BEMÆRK: Til fremstilling af CPA-opløsningen opløses 10,26 g saccharose fuldstændigt i ca. 20 ml destilleret H₂O indeholdende 3 ml 10 x EBR-opløsning. Der tilsættes 6 ml ethylenglycol og derefter destilleret_H2Oop til 30 ml. Efter grundig blanding filtreres opløsningen gennem en 0,22 mm engangsmembran.
4. Indsamling af PGC'er
   1. PGC-opsamlingsglasglasset i trin 2.3.2 anbringes på scenen i et mikroskop udstyret med et mikromanipulatorsystem. Sæt nålen på kapillærholderen, og før det første embryo i venstre række og nålespidsen ind i samme brændplan. Læg silikoneolie i nålen i 2-3 s.
   2. Begynd PGC-indsamling fra embryoner i venstre række. Brug en 20x objektivlinse til forsigtigt at flytte nålespidsen til overfladen af den forreste ende af embryoet og trænge ind i embryoet mod den bageste ende, ikke ved at flytte nålen, men ved at flytte mikroskopstadiet.
   3. Når nålespidsen når den bageste ende, trækkes nålen lidt tilbage, og æggeblommen i nålen aflades helt lige inden for det somatiske cellelag.
   4. Mens trykket i nålen holdes konstant, skal du flytte nålespidsen til PGC'erne lige inden for den bageste pol og forsigtigt lægge PGC'erne i, men uden at tage meget tid.
   5. Træk nålen hurtigt ud af embryoet og udled æggeblomme og andre forurenende stoffer fra nålen i silikoneoliepuljen, og hold PGC'erne i nålen. Læg derefter ren silikoneolie fra poolen.
   6. Trin 2.4.2 til 2.4.5 gentages for de øvrige embryoner i venstre række. Før du indsamler PGC'er fra et nyt embryo, skal du deponere så meget af silikoneolien, der er fyldt i trin 2.4.5, inde i det somatiske cellelag som muligt, mens du holder indlæste PGC'er i nålen. Dette sikrer, at nyligt indlæste PGC'er støder op til de tidligere indsamlede PGC'er uden mellemliggende materiale mellem dem.
   7. Efter at have afsluttet PGC-opsamling fra embryoner i venstre række, skal du adskille PGC'er fra æggeblommen og andre forurenende stoffer så meget som muligt. For at opnå dette skal du deponere alle PGC'er i nålen på overfladen af et embryo og fjerne æggeblomme eller andre forurenende stoffer til et andet nærliggende embryo.
   8. Saml derefter PGC'er fra embryoner i højre række. Kombiner PGC'erne indsamlet fra højre og venstre række.
5. Anvendelse af kryoprotektive midler (CPA) på PGC'er
   1. Efter vask af nålen med CPA i en dråbe, lægges frisk CPA i en anden dråbe i nålen og tilsættes CPA til de PGC'er, der er deponeret på embryoet. CPA-mængden bør svare til mængden af PGC'er.
   2. Fjern så meget CPA som muligt fra klyngen af PGC 1-2 s efter tilføjelsen af CPA. PGC'er krymper lidt og bliver firkantede i form umiddelbart efter CPA-tilføjelse.
   3. Tøm kanylen, og læg derefter silikoneolie i 5 sekunder eller længere. Læg alle de indsamlede PGC'er i, og læg derefter silikoneolie igen i 5 sekunder eller længere. PGC'er er nu klemt inde mellem to lag silikoneolie (figur 2B).
      BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne så meget æggeblomme, CPA og andre forurenende stoffer som muligt.
6. Kryokonservering af PGC'er
   1. Åbn trevejsstophanen (figur 1C), og tag derefter nålen af mikromanipulatoren. Blott olien af kanylens overflade med blødt silkepapir. Rør ikke direkte ved kanylespidsen med vævet.
   2. Sæt nålen på en nåleholder, og lås den på plads ved bunden ved hjælp af vinyltape (figur 1H). Sæt en etiket på holderrøret.
   3. Lynfrys holderen med nålen pegende nedad ved at nedsænke den i flydende nitrogen. Slip ikke holderen, før væsken holder op med at bruse ud af stativet.
   4. Opbevar holderen i en opbevaringstank med flydende nitrogen i væskefaseområdet, ikke dampfaseområdet.

3. Optøning og transplantation af PGC'er

1. Indsamling, dechorionering og justering af embryoner fra agametiske værtsfluer
   1. Opsaml og dechorioner embryoner fra agametiske værtsfluer efter trin 2.
   2. Juster fase 5 agametiske værtsembryoner på et transplantationsglasglas. Denne gang skal du dog orientere den bageste til højre (den side, der skal manipuleres) og ventral til toppen (figur 5). Stil ca. 30 embryoner op i to rækker på 20 min.
   3. Mens du justerer embryoner, skal du betjene en luftfugter i 2-10 minutter, hvis rumfugtigheden kræver det (tabel 1). Den ideelle luftfugtighed er 30% til 40%, men dette kan variere afhængigt af termiske forhold.
2. Optøning og transplantation af PGC'er i værtsembryoner
   1. For hurtigt at optø kryopræserverede PGC'er skal du sætte holderen med nålen i stuetemperatur 1x EBR-opløsning med nålen pegende nedad og holde den nedsænket i 10 sekunder.
   2. Placer transplantationsglasobjektglasset på scenen af et mikroskop. Sæt den fryseoptøede kanyle på kapillærholderen, og før det første embryo i venstre række og nålespidsen ind i samme brændplan.
   3. Brug en 20x objektivlinse til forsigtigt at flytte nålespidsen til overfladen af den bageste ende af embryoet.
   4. Stik forsigtigt ydersiden af hvert embryo og sørg for, at de langsomt vender tilbage til deres oprindelige form. Prodding vil bekræfte, at embryoets indre tryk ikke er for højt eller for lavt.
   5. Flyt forsigtigt nålen og træng ind i et embryo fra den bageste pol.
   6. Afsæt forsigtigt ca. 10-20 PGC'er lige inden for den bageste pol, præcist mellem vitellinmembranen og embryoets somatiske cellelag. Undgå at deponere dem i det somatiske cellelag. Hvis perivitellinvæsken lækker ud af embryoet, skal du suge den lækkede væske ind i nålen og fjerne den.
   7. Træk nålen tilbage fra embryoet. Trin 3.2.5 og 3.2.6 gentages for efterfølgende embryoner.

4. Inkubation af embryoner og genopretning af donorstammer

1. Embryoner, der ikke modtager transplanterede PGC'er, fjernes, og de resterende embryoner inkuberes i et befugtet kammer (figur 1G) ved 25 °C.
2. 24 timer eller mere efter transplantation og så hurtigt som muligt efter udklækning anvendes pincet til at opsamle og overføre klækkede larver til standard hætteglas med Drosophila-foder og inkubere ved 25 °C.
3. For at genoplive stammen krydses nyligt fremkomne kvinder og hanner (figur 6).
   BEMÆRK: Agametiske værter gør det muligt at genoprette hele genomet på én gang uden at krydse til balancer-kromosomstammer. Sameksistensen af agametiske hanner i et hætteglas betyder ikke noget, fordi hunner, selvom de parres med dem, ikke viser langsigtede reaktioner efter parring, herunder nedsat modtagelighed for at remittere^18,19.

Discussion

En kritisk faktor for succes i PGC kryopræservering og genoplivning er at bruge gode embryoner. Unge hunner (f.eks. 3 til 5 dage gamle) bør anvendes til embryoindsamling. Både donor- og værtsembryoner vurderes ved mikroskopisk inspektion, og kun embryoner på blastoderm-stadiet (stadium 5) anvendes¹². Til PGC-indsamling justerer vi normalt ca. 40 donorembryoner i en periode på 20 minutter og indsamler PGC'er fra ca. 30 embryoner tidligt i fase 5; Ældre og defekte embryoner anvendes ikke. Efter kryopræservering og optøning skal PGC'er bevare deres form; PGC'er brister i mislykket bevarelse. Værtsembryoner skal også være i fase 5 og have et moderat indre tryk; Embryoner skal langsomt vende tilbage til deres oprindelige form efter blid prodding. Alt for og utilstrækkeligt tørrede embryoner vil ikke udvikle sig normalt efter transplantation. Fordi heteroseksuel transplantation af PGC'er ikke producerer kønsceller i Drosophila ^5,10, er transplantation af PGC'er fra flere donorembryoner til værtsembryoner mere tilbøjelige til at give frugtbare voksne. Til dette formål indsamler vi normalt PGC'er fra ca. 30 embryoner pr. Nål.

Som kryoprotektorer prøvede vi ethylenglycol, dimethylsulfoxid og glycerol sammen med saccharose i forskellige koncentrationer. Vi fastslog, at EBR indeholdende 20% ethylenglycol og 1 M saccharose var de bedste¹³; brugen af forskellige kryoprotektorer kan dog forbedre PGC-bevarelsen²².

Denne kryopræserveringsmetode kræver specialiserede færdigheder i PGC-håndtering, og ca. 6 ugers træning er nødvendig for komfortabelt at indsamle og transplantere PGC'er. For at vurdere og forbedre færdighedsfærdigheder kan dette opdeles i seks træningstrin: 1) justering af embryoner på et glasglas, 2) styring af en manipulator, 3) transplantation af PGC'er fra et embryo til et andet embryo uden kryopræservering, 4) transplantation af PGC'er fra 10 eller flere embryoner til 5 til 10 embryoner, 5) transplantation af PGC'er efter påføring af CPA og 6) transplantation af PGC'er efter fryseoptøning. Hvert trin kan tage 1 uge. De kortsigtede mål på trin 3 er en udklækningsrate på 40%, embryo-til-voksen levedygtighed på 10% -20% og en hyppighed af frugtbare fluer på 20%.

PGC-kryopræservering kræver dyr instrumentering og højt kvalificeret personale. Derfor kan denne metode ikke vedtages af mange laboratorier. Den nuværende PGC-metode har imidlertid flere vigtige aspekter. For det første er PGC'er meget mindre end embryoner og er meget gennemtrængelige for kryoprotektorer. I modsætning hertil er kryoprotektiv permeabilitet stærkt begrænset af de voksagtige lag af Drosophila-embryoner, hvilket er det mest alvorlige problem ved embryokryopræservering. Faktisk har tidligere undersøgelser gjort en stor indsats for at finde et tidsvindue, hvor embryoner har en høj overlevelsesrate og et tyndere vokslag. Den anden beskæftiger sig med udviklingsmæssig og morfologisk variation blandt stammer. PGC'er indsamles fra embryoner i tidlig fase 5 (2 timer og 30 min-3 timer og 20 minutter efter æglægning), mens embryokryopræservering udføres på embryoner i trin 16 (14-22 timer efter æglægning). Fostrene er derfor meget ældre og udviser meget større stammevariation i det optimale tidsvindue for kryopræservering sammenlignet med PGC-kryopræservering. Faktisk varierede hyppigheden af værter, der producerede donorafledt afkom, ikke mellem fem stammer undersøgt af Asaoka et ^al.13, selvom værterne ikke var agametiske. Desuden har PGC'er potentialet til at blive brugt i genteknologiske applikationer, såsom genomredigering 14,15,16.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	017-00256	For embryo collection
Agar powder	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	010-08725	For embryo collection
Calcium chloride	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	038-24985	For EBR solution
Capillary	Sutter Instrument	B100-75-10-PT	BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs
Capillary holder	Eppendorf	5196 081.005	Capillary holder 4; for micromanipulation
Chromic acid mixture	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	037-05415	For needle washing
CPA solution			1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose
Double-sided tape	3M	Scotch w-12	For glue extracting
Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR)			130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9
Ethanol (99.5)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	057-00451	For embryo collection
Ethylene glycol	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	054-00983	For CPA solution
Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish	Corning Inc.	351006	For embryo collection
Forceps	Vigor	Type5 Titan	For embryo handling
Grape juice	Asahi Soft Drinks Co., LTD.	Welch's Grape 100	For embryo collection
Grape juice agar plate			50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid
Heptane	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	084-08105	For glue extracting
Humidifier	APIX INTERNATIONAL CO., LTD.	FSWD2201-WH	For embryo preparation
Inverted microscope	Leica Microsystems GmbH	Leica DM IL LED	For micromanipulation
Luer-lock glass syringe	Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.	0550 14 71 08	Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation
Mechanical micromanipulator	Leica Microsystems GmbH		For micromanipulation
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind., Ltd.	S-2441	For embryo aligning
Microgrinder	NARISHIGE Group	Custom order	EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation
Microscope camera	Leica Microsystems GmbH	Leica MC170 HD	For micromanipulation
Needle holder	Merck KGaA	Eppendorf TransferTip (ES)	For cryopreservation
Potassium chloride	Nacalai Tesque, Inc.	28514-75	For EBR solution
Puller	NARISHIGE Group	PN-31	For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0.
PVC adhesive tape for electric insulation	Nitto Denko Corporation	J2515	For embryo-pool frame
Silicon oil	Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd.	FL-100-450CS	For embryo handling
Sodium chloride	Nacalai Tesque, Inc.	31320-05	For EBR solution
Sodium hypochlorite solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	197-02206	Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching
Sucrose	Nacalai Tesque, Inc.	30404-45	For CPA solution