אוטומציית סינון מיקרוסקופיה Cryo-Electron על פני רשתות מרובות באמצעות Smart Leginon

Summary

מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (cryoEM) סינון רב רשתות הוא לעתים קרובות תהליך מייגע הדורש שעות של תשומת לב. פרוטוקול זה מראה כיצד להגדיר אוסף Leginon סטנדרטי ומסך אוטומטי חכם Leginon כדי להפוך תהליך זה לאוטומטי. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רוב רשתות רדיד אלומיניום חורי cryoEM.

Abstract

ההתקדמות בטכניקות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים (cryoEM) בעשור האחרון אפשרה לביולוגים מבניים לפתור באופן שגרתי קומפלקסים של חלבונים מקרומולקולריים לרזולוציה כמעט אטומית. זרימת העבודה הכללית של כל צינור ה- cryoEM כוללת חזרה בין הכנת דגימה, הכנת רשת cryoEM וסינון דגימה/רשת לפני המעבר לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה. איטרציה בין הכנת הדגימה/רשת לבין הסינון היא בדרך כלל צוואר בקבוק משמעותי עבור חוקרים, מכיוון שכל ניסוי איטרטיבי חייב למטב את ריכוז הדגימה, תנאי החיץ, חומר הרשת, גודל חור הרשת, עובי הקרח והתנהגות חלקיקי החלבונים בקרח, בין משתנים אחרים. יתר על כן, לאחר שמשתנים אלה נקבעים באופן משביע רצון, רשתות שהוכנו בתנאים זהים משתנות במידה רבה בשאלה אם הן מוכנות לאיסוף נתונים, ולכן מומלץ לבצע מפגשי סינון נוספים לפני בחירת רשתות אופטימליות לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה. תהליך הכנה וסינון של דגימה/רשת גוזל לעתים קרובות כמה עשרות רשתות וימים של זמן מפעיל במיקרוסקופ. יתר על כן, תהליך הסינון מוגבל לזמינות המפעיל/מיקרוסקופ ולנגישות המיקרוסקופ. כאן, אנו מדגימים כיצד להשתמש ב- Leginon וב- Smart Leginon Autoscreen כדי להפוך את רוב סינון רשת cryoEM לאוטומטי. מסך אוטומטי משלב למידת מכונה, אלגוריתמים של ראייה ממוחשבת ואלגוריתמים לטיפול במיקרוסקופ כדי לבטל את הצורך בקלט מפעיל ידני קבוע. מסך אוטומטי יכול לטעון ולצלם רשתות באופן אוטונומי עם הדמיה בקנה מידה גדול באמצעות מערכת אוטומטית להחלפת קלטות, וכתוצאה מכך סינון רשת ללא השגחה עבור קלטת שלמה. כתוצאה מכך, זמן המפעיל לסינון 12 רשתות עשוי להתקצר ל~10 דקות עם מסך אוטומטי בהשוואה ל~6 שעות בשיטות קודמות אשר נפגעות על ידי חוסר היכולת שלהן להסביר שונות גבוהה בין רשתות. פרוטוקול זה מציג תחילה הגדרה ופונקציונליות בסיסיות של Leginon, ולאחר מכן מדגים פונקציונליות מסך אוטומטי שלב אחר שלב מיצירת הפעלת תבנית ועד לסוף סשן סינון אוטומטי בן 12 רשתות.

Introduction

מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים של חלקיק יחיד (cryoEM) מאפשר קביעת מבנה ברזולוציה כמעט אטומית של קומפלקסים מקרומולקולריים מטוהרים. ניסוי cryoEM של חלקיק יחיד דורש רק רשת אחת או שתיים שנבחרו בקפידה שנבחרו מתוך קבוצה גדולה בהרבה של רשתות עם תנאי דגימה ורשת משתנים. סינון מיקרוסקופ כדי לבחון רשתות אלה כרוך בהדמיה של כל רשת במספר הגדלות כדי לקבוע איזו רשת עונה על רוב דרישות המפתח לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה, כולל עובי קרח, אזורים מספיקים לאיסוף נתונים מלא, טוהר חלבונים, ריכוז חלבונים, יציבות חלבונים ובעיות אוריינטציה מועדפות מינימליות¹. אופטימיזציה עבור דרישות מפתח אלה כרוכה לעתים קרובות במשוב בין סינון במיקרוסקופ לבין תנאי הכנה כגון ייצור חלבונים, בחירת חיץ, דטרגנטים פוטנציאליים וסוג רשת ^2,3,4 (איור 1). סינון רשת קונבנציונלי מתבצע באופן ידני או חצי ידני עם תוכנות כגון Leginon⁵, SerialEM⁶ ו- EPU⁷. סינון קונבנציונלי דורש ממפעיל המיקרוסקופ לבלות שעות במיקרוסקופ כדי לסנן מספר רשתות, מה שיוצר צוואר בקבוק משמעותי בתהליך העבודה של חלקיק בודד ברזולוציה גבוהה על ידי עיסוק המפעיל בפעולות רוטציה במקום אופטימיזציה של דגימה/רשת.

בעבר, המסך האוטומטי Smart Leginon ותוכנת למידת המכונה הבסיסית, Ptolemy, הוצגו, והשיטות והאלגוריתמים הבסיסיים שלהם יחד עם דוגמאות תוארו ^8,9. מספר חבילות תוכנה אחרות מסוגלות או פועלות לקראת סינון אוטומטי לחלוטין של רשתות^{מרובות 10}, כולל SmartScope¹¹, Smart EPU¹² ו- CryoRL^13,14. כדי לטפל בצוואר הבקבוק של ההקרנה, Smart Leginon מאפשר למשתמש להגדיר תחילה פרמטרי סינון בסשן מיקרוסקופ תבנית, ולאחר מכן להשתמש בפרמטרים של סשן תבנית זו כתבנית כדי לסנן את קלטת הרשתות המלאה בטוען האוטומטי של המיקרוסקופ. כל העבודה הידנית במהלך סינון הקלטות מתבטלת, מה שמאפשר ללולאת משוב האופטימיזציה להתקדם בצורה יעילה יותר באופן משמעותי.

בפרוטוקול זה, זרימת העבודה המלאה של המסך האוטומטי Smart Leginon מתוארת כך שהקורא יכול לבצע סינון קריוEM מרובה רשתות אוטומטי לחלוטין באופן עצמאי. עבור אלה החדשים לגינון, החלק הראשון בפרוטוקול מתאר את השימוש המקובל בלגינון. ידע זה מורכב ממספר שנות ניסיון במספר מיקרוסקופים של טוען אוטומטי, אשר נבנה לאחר מכן בחלק הבא של Smart Leginon של הפרוטוקול. סרטוני הדרכה נוספים ניתן למצוא באתר https://memc.nysbc.org.

Protocol

כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, המתואר באיור 2, Leginon 3.6+ צריך להיות מותקן במחשב המיקרוסקופ ובתחנת עבודה נוספת של Linux, ותלמי צריך להיות מותקן על תחנת העבודה של Linux. פרוטוקול זה פותח במשך מספר שנים באמצעות מיקרוסקופים של Thermo Fisher Scientific (TFS) Glacios ו-Krios. פרוטוקול זה מניח שהקורא כבר הגדיר את Leginon, Appion¹⁵, מסד הנתונים המשויך, כיול מיקרוסקופ, ביצע יישור ישיר במיקרוסקופ, והקים שני יישומי לגינון: אחד לאיסוף חלקיקים בודדים סטנדרטיים ואחד לאוסף חלקיקים בודדים עם תלמי. מידע להקמת לגינון זמין כאן: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual. מידע להקמת תלמי בתוך לגינון זמין כאן: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening. הורד את Leginon http://leginon.org ואת Ptolemy מ-https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy. Leginon מורשה תחת רישיון Apache, גרסה 2.0, ותלמי מורשה תחת CC BY-NC 4.0.

1. שימוש בלגינון

1. התחל את Leginon
   1. במחשב Windows במיקרוסקופ, סגור את כל לקוחות Leginon ולאחר מכן פתח אותו מחדש. בתחנת העבודה Linux, פתח חלון מסוף והקלד start-leginon.py או את הכינוי המתאים של המערכת להפעלת Leginon.
   2. בחלון החדש Leginon Setup , בחר Create a new session ולחץ על Next.
   3. בחר את הפרויקט מהרשימה הנפתחת ולחץ על הבא.
   4. השאר את השם כפי שהוא, בחר את המחזיק הנכון עבור הגדרת המיקרוסקופ ולחץ על הבא.
   5. עבור התיאור, הזן/י מידע רלוונטי כגון שם המיקרוסקופ, תיאור הרשת/הדגימה ותיאור הניסוי, ואז לחץ/י על ״הבא״.
   6. לספריית התמונות, ודאו שמערכת הקבצים המתאימה נבחרה ושהנתיב המלא מתאים לשמירת תמונות, ואחר כך לחצו על 'הבא'.
   7. תחת התחבר ללקוחות, לחץ על ערוך. בתפריט הנפתח, בחר את כל המחשבים שאמורים להיות מחוברים ולחץ על לחצן + עבור כל אחד מהם ולאחר מכן לחץ על אישור ועל הבא.
   8. הזן את גודל הצמצם הנכון של C2 ולחץ על הבא. ניתן למצוא ערך זה בכרטיסייה Apertures של תוכנת TFS TUI.
2. ממשק Leginon
   1. בחר יישום מסרגל הכלים ולחץ על הפעל.
   2. בחר את היישום המתאים מהתפריט הנפתח (לחץ על הצג הכל במידת הצורך). הגדר את הראשי למחשב Leginon ואת הטווח והמצלמה למחשב המתאים ולאחר מכן לחץ על הפעל. הצד השמאלי של חלון הלגינון הראשי יאוכלס בצמתים.
      הערה: החלונית השמאלית מציגה את כל צמתי הלגינון. צמתי סמל המצלמה הירוקה הם התמונות שיישמרו: רשת, ריבוע, חור וחשיפה. צמתים עם סימן היעד הם תמונות בהגדלה נמוכה יותר למיקוד תמונות בהגדלה גבוהה יותר. צמתי המצלמה הסגולים הם הצמתים המתוכנתים למצוא גובה z אאוצנטרי ומיקוד אאוצנטרי. בנוסף, ישנם צמתים ליישור שיא אובדן אפס, ניטור מחזור חיץ, ניטור מילוי חנקן נוזלי, איסוף תמונות תיקון רווח, חישוב עובי קרח (IceT) וניווט ברשת דרך הגדלות שונות באמצעות שינוי שלב ותמונה.
   3. מנהל קביעות מוגדרות מראש
      1. לחץ על הצומת Presets_Manager. בצומת זה, לחצו על הסמל התחתון לייבוא קביעות מוגדרות מראש או על הסמל שמעליו ליצירת קביעה מוגדרת מראש חדשה מהמצב הנוכחי של המיקרוסקופ.
      2. אם לוחצים על הסמל התחתון, ייפתח חלון ייבוא קביעות מוגדרות מראש . בחר את ה- TEM והמצלמה הדיגיטלית הנכונות ולאחר מכן לחץ על חפש ובחר את ההפעלה האחרונה עם ההגדרות המוגדרות מראש הרצויות. סמנו את כל הקביעות המוגדרות מראש הרצויות ולחצו על 'ייבא' ולאחר מכן לחצו על 'סיום'.
         הערה: הצומת מנהל קביעות מוגדרות מראש אמור כעת לפרט את כל הקביעות המוגדרות מראש שיובאו ונוצרו. מומלץ שיהיו קביעות מוגדרות מראש למספר הגדלות ומיקוד, כולל gr: הגדלת רשת, sq: הגדלה מרובעת, hln: הגדלת חור, מאוורר: מיקוד אוטומטי, fcn: מיקוד מרכזי, enn: הגדלת חשיפה (נגרר 'n' מתייחס nanoprobe). פרמטרים מוגדרים מראש אופייניים לכל הגדלה מוצגים בטבלה 1, טבלה 2 וטבלה 3. שים לב שפרוטוקול זה משתמש בצמצם C2 בגודל של 70 מיקרומטר עבור Glacios, 50 מיקרומטר עבור Krios עם Selectris X ו- Falcon 4i, ו- 100 מיקרומטר עבור Krios עם BioQuantum עם K3.
   4. ניווט וגובה אאוצנטרי
      1. כדי להכיר את השליטה במיקרוסקופ באמצעות Leginon ולהגדיר את גובה z של הרשת, עבור אל צומת ניווט, בחר את הגדרת gr המוגדרת מראש בחלק העליון, ולחץ על החץ האדום ימינה כדי לשלוח את ההגדרות המוגדרות מראש למיקרוסקופ. המיקרוסקופ אמור להתעדכן לאחר 1-2 שניות. לאחר העדכון, לחץ על לחצן המצלמה מימין כדי לקבל תמונה.
      2. בעזרת הכלי סמן, בחרו ריבוע רשת למקום הזזת הבמה. לחץ על ההגדלה בריבוע ולאחר מכן על החץ האדום כדי לשלוח למיקרוסקופ, ולחץ על לחצן המצלמה כדי לקבל תמונה.
      3. עבור לצומת Z_Focus ולחץ על הדמיית יעד כפתור בחלק העליון ליד אמצע הכפתורים. בזמן שהתמונות נאספות לצורך מיקוד הטיית הבמה, עברו לתצוגת מתאם וצפו בשיא כדי לוודא שהוא נמצא בפינה של תמונת המתאם. לאחר סיום ההתמקדות, ודא שהבמה מוגדרת לגובה z של הרשת.
   5. תיקון תרדמת
      הערה: תת-סעיף זה מניח שכבר בוצעו יישור ישיר וכי לא בוצעו תיקוני תרדמת.
      1. נווט לאזור ברשת שמפיק טבעות תון ברורות, כגון מצע פחמן.
         הערה: ניתן להשתמש בסורג צולב אם האיסוף נעשה על רשת זהב.
      2. בקביעות Beam_Tilt_Image, ודא שסדר הקביעות המוגדרות מראש כולל רק fcn עם ארבעה כיווני הטיה בזווית של 0.005 רדיאנים.
      3. לחץ על Simulate Target כדי ליצור טבלת Zemlin. לחץ על Tableau בצד שמאל של החלון הראשי כדי להציג את הטבלה.
      4. נכון לתרדמת על ידי השוואת התמרות פורייה השמאלית והימנית זו עם זו, והתמרות פורייה העליונה והתחתונה זו עם זו. אם זוגות התמונות אינם זהים, לחצו תחילה על סמל הסמן מימין להתאמות התמונה, לאחר מכן לחצו מעט מחוץ למרכז בתמונת Tableau בכיוון ההפרש והמתינו לאוסף קבוצה חדשה של המרות פורייה. חזרו על הפעולה עד שהתמרות פורייה זהות.
         הערה: השלמת כל לחיצה על Tableau נמשכת מספר שניות, ואין לבצע לחיצות נוספות במהלך פרק זמן זה.
   6. השג הפניות
      הערה: דלג על סעיף זה אם המצלמה כוללת הפניות חומרה אוטומטיות.
      1. בצומת ניווט, שלח קביעה מוגדרת מראש של הגדלה נמוכה, כגון gr, ונווט לאזור שבו אין הפרעה לנתיב האלומה.
      2. ודא שמיקום הבמה נמצא במיקום שאינו חסום על-ידי נתיב הקרן על-ידי צילום תמונת הגדלה בינונית באמצעות הקביעה המוגדרת מראש sq או hln .
      3. שלח את ההגדלה הגבוהה enn להגדיר מראש למיקרוסקופ.
      4. בהגדרות צומת התיקון, בחר את פרטי ההתקן המתאימים והגדר את תצורת המצלמה כך שתתאים להגדרות האיסוף.
      5. אסוף תמונת ייחוס כהה על-ידי סגירת שסתומי העמודות במיקרוסקופ, ולאחר מכן, בצומת תיקון, בחר כהה ושני הערוצים מהתפריטים הנפתחים בחלק העליון ולחץ על הלחצן רכוש מצלמה מימין.
      6. לאחר שתסיים, בחר בהיר מהתפריט הנפתח ולחץ על רכישה. לגינון יפתח את שסתומי העמודים באופן אוטומטי.
      7. ודא שהרווח נאסף כראוי על-ידי בחירה באפשרות תוקן מהתפריט הנפתח, לחיצה על רכוש והתבוננות בתמונה המתקבלת.
   7. תמונת הפניה לעובי קרח
      1. אם במיקרוסקופ יש מסנן אנרגיה, בהגדרות צומת IceT, סמן את תמונת איסוף עובי קרח, הזן 395 עבור הנתיב החופשי הממוצע ומלא את שאר הערכים עבור ההתקנה.
      2. אם למיקרוסקופ אין מסנן אנרגיה, אז בצומת ניווט, שלח את הגדרת enn המוגדרת מראש למיקרוסקופ ולחץ על רכישה. רשום לעצמך את ערך הפיקסל הממוצע בצד שמאל. בהגדרות צומת IceT, סמן את חשב עובי קרח מפיזור מוגבל של צמצם, הזן 1055 עבור מקדם ALS וערך הפיקסלים הממוצע הנמדד.
         הערה: הערכים 395 ו- 1055 נקבעו עבור TFS Krios ו- Glacios, בהתאמה, כפי שתואר קודם לכן¹⁶, וייתכן שיהיה צורך לכייל אותם מחדש עבור תצורות מיקרוסקופ שונות.
   8. כיול מינון תמונה
      1. Preset_Manager, בחרו בקביעה המוגדרת מראש enn ולחצו על לחצן המצלמה ('קבל תמונת מינון' לקביעה המוגדרת מראש שנבחרה). בדוק את המינון הנמדד בתחתית. אם הוא קרוב לערך הצפוי (בדרך כלל בין 30 ל- 70), לחץ על כן.
   9. יישור מוגדר מראש
      1. Preset_Manager, בדקו את כל ההגדרות המוגדרות מראש של ההגדלה הגבוהה (enn, fcn ומאוורר) כדי לוודא שהיסט התמונה והיסט הקרן הם 0, 0.
      2. במחשב המיקרוסקופ, נווט לאזור פחמן.
      3. במחשב Leginon בצומת הניווט, רכוש תמונה עם ההגדרה המוגדרת מראש gr .
      4. מצא אובייקט מעניין ועבור למיקום זה באמצעות כלי הסמן.
      5. רכשו תמונה עם הקביעה המוגדרת מראש hln והעבירו חלק ייחודי של אובייקט זה למרכז בעזרת הכלי הסמן.
      6. רכשו תמונה עם הקביעה המוגדרת מראש enn ומקמו אותה מחדש לאותו חלק ייחודי של מושא העניין באמצעות הכלי הסמן.
      7. בחר הזחת תמונה מהתפריט הנפתח וקבל תמונה עם הקביעה המוגדרת מראש hln. עבור לאותו חלק ייחודי של מושא העניין באמצעות הכלי הסמן.
      8. Presets_Manager, בחרו בקביעה המוגדרת מראש hln, לחצו עלהלחצן s ettings וייבאו את הזזה התמונה מ'ניווט' בלחיצה על החץ הירוק שמאלה שליד ערכי ההזזה של התמונה.
      9. חזור על שלבים 2.9.7 ו- 2.9.8 לקביעות המוגדרות מראש sq ו - gr .
   10. אטלס רשת
       1. במחשב המיקרוסקופ, סגור את שסתומי העמודות ומשוך את הצמצם האובייקטיבי. עבור אל הצומת Grid_Targeting. בהגדרות, שנה את תווית הרשת. בחר את הרדיוס הרצוי של האטלס (הרדיוס המרבי הוא 0.0009 מ '). לחץ על אישור. לאחר מכן לחץ על מחשבון אטלס חשב כפתור בחלק העליון ולחץ על כפתור ההפעלה הירוק ('שלח יעדים').
       2. בצומת Square_Targeting, תמונות הרשת ייאספו וייתפרו יחד ליצירת אטלס. הגדל והקטן את התצוגה באמצעות התפריט הנפתח והתאם את הניגודיות והבהירות. השתמש בסרגלי הגלילה כדי לנוע ברחבי הרשת.
       3. לאחר איסוף האטלס, הכנס את הצמצם האובייקטיבי אם תרצה.
       4. אם במיקרוסקופ יש מסנן אנרגיה, בחר יעד ייחוס במרכז ריבוע שבור, לחץ על לחצן Play והמשך ליישור ZLP בתת-הסעיף הבא. אחרת, דלג על שלב היישור של ZLP.
   11. יישור ZLP
       1. בהגדרות צומת Align_ZLP, בחר Stage position כדי להזיז את יעד ההפניה ובחר מנהל קביעות מוגדרות מראש כמניע. בטלו את הבחירה במזגן העוקף ולחצו על הלחצן 'אשר'.
          הערה: כעת יש להגדיר את יישור ZLP כך שהמיקרוסקופ יעבור מעת לעת ליעד הייחוס ויבצע את שגרת יישור ה-ZLP של המצלמה. זמני יישור מחדש של ZLP של 30 דקות ו-60 דקות בטוחים בדרך כלל עבור מסנני האנרגיה Gatan BioQuantum ו-TFS Selectris X, בהתאמה. ערכים אלה משתנים בהתאם לתנאי מסנן האנרגיה, כולל לחות עקבית, טמפרטורה עקבית, בידוד שדה אלקטרומגנטי ובידוד רטט.
   12. הגדרת פילוח תבנית חור
       1. בצומת Square_Targeting, בחר/י יעדי רכישה מרובים ולאחר מכן לחץ/י על ״הפעל״.
       2. בהגדרות צומת Hole_Targeting, ודא שהאפשרות אפשר אימות משתמש של יעדים נבחרים ויעדים בתור מסומנת. כמו כן, בדוק דלג על מאתר חורים אוטומטי לעת עתה. לחץ על החל ולאחר מכן על אישור.
       3. בחלון הראשי, השתמש ב - Ctrl-Shift-לחיצה ימנית כדי להסיר את כל היעדים. בחר את סמן הרכישה והצב את היעדים. בחר את סמן המיקוד והצב יעד מיקוד בין יעדי הרכישה. לחץ על הפעל.
       4. לתמונת Hole_Targeting הבאה, בטל/י את הסימון של ״דלג על מאתר החורים האוטומטי״ בהגדרות ולאחר מכן לחץ/י על ״החל ואישור״. הסר את היעדים האוטומטיים בלחיצה ימנית Ctrl-Shift.
       5. בחרו בכלי סרגל ומדדו את הקוטר לרוחב חור. בהגדרות התבנית, שנה את קוטר התבנית הסופית לקוטר החור הנמדד. אל תשנה את קוטר התבנית המקורית. לחץ על בדיקה. אם פסגות בהירות אינן נמצאות במרכז כל חור, הגדל את קוטר התבנית הסופית. כשתסיים, לחץ על אישור.
       6. בהגדרות 'סף', בחר ערך בתיבה A שמפלח את החורים בנפרד בשעת לחיצה על 'בדיקה '. לחץ על אישור כאשר אתה מרוצה.
       7. בהגדרות Blobs, הזן את הערכים ולחץ על Test. ערך הכתמים המרביים הוא 1 כך שרק כתם אחד מופיע. לחץ על אישור.
       8. בקביעות סריג, השתמש בכלי סרגל למדידת המרחק בין שני חורים (ממרכז למרכז). הזן את הערך במרווח ולחץ על בדוק. הגוש האחד יהפוך לנקודת סריג. לחץ על אישור.
       9. עבור אל הגדרות רכישה, ומטב את יעדי הרכישה באמצעות ספי עובי קרח ולחצן בדוק מיקוד. קבל מידע על עובי הקרח על ידי ריחוף מעל נקודות הסריג.
       10. אם יעדי הרכישה אינם מספקים, השתמש בכלי סרגל כדי למדוד את המרחק והזווית מנקודת הסריג למיקום הרצוי עבור יעד רכישה. מחק את נקודות תבנית היעד הקודמות של רכישה . לחץ על מילוי אוטומטי, שים 4 עבור מספר המטרות, ושנה את הרדיוס והזווית לערכים הנמדדים. לחץ על אישור. סמן את החל סף עובי קרח על יעדי רכישה מפותלים בתבנית.
       11. לאחר שתהיו מרוצים מנקודות הסריג ומסף עובי הקרח, לחצו על הלחצן 'שלח יעדים '.
       12. חזור על כל אחד מהשלבים לעיל לפי הצורך עבור כל ריבוע שנבחר. שלח את כל התור באמצעות לחצן שלח יעדים בתור לאחר שליחת כל היעדים המרובעים.
       13. לגינון יתחיל להתמקד ולצלם כל סט מטרות. בצומת Z_Focus, ודא כי הגובה eucentric נמצא כראוי.
   13. הגדרת מיקוד תבנית חשיפה
       1. בצומת מיקוד חשיפה, יופיעו תמונות הגדלת חורים. השתמש ב- Ctrl-Shift-לחיצה ימנית כדי להסיר את היעדים האוטומטיים.
       2. מדוד את קוטר החור בעזרת הכלי סרגל. בהגדרות התבנית, הזן את הקוטר לקוטר התבנית הסופית ולחץ על בדוק. שיא צריך להיות עכשיו במרכז כל חור. התאם את ערכי הקוטר במידת הצורך.
       3. בהגדרות סף, התאם את הערך A עד שתמונת הבדיקה הבינארית תציג רק אזורים לבנים שבהם ממוקמים חורים.
       4. בהגדרות Blobs, לחץ על Test. כתם אחד לכל חור מקוטע אמור להופיע. הגדילו את הגבול כדי להסיר את הכתמים מקצות התמונה, אם תרצו.
       5. בהגדרות הסריג, לחץ על בדיקה. התאם פרמטרים עד שכל הכתמים יהפכו לנקודות סריג. לחץ על אישור.
       6. לחצו על כלי הסרגל ומדדו את המרחק בין שתי נקודות סריג. בהגדרות הסריג, שנה את המרווח למרחק זה.
       7. רחף מעל כל נקודת סריג כדי לראות את העוצמה הממוצעת, העובי הממוצע, עוצמת סטיית התקן ועובי סטיית התקן. רשום לעצמך את העוצמות עבור כל נקודת סריג והשתמש בהן כדי להגדיר פרמטרים רצויים של עובי קרח בהגדרות הרכישה.
       8. מדוד את המרחק והזווית מנקודת סריג אחת למרכז של 4 חורים בעזרת הכלי סרגל. בהגדרות הרכישה, מחק את יעדי המיקוד הנוכחיים. לחצו על 'מילוי אוטומטי' ושנו את הרדיוס והזווית לערכים הנמדדים. לחץ על Test targeting, לחץ על OK ולחץ על Submit Targets.
          הערה: Leginon ימצא מיקוד אאוצנטרי (צומת מיקוד) ויאסוף חשיפות, שיופיעו בצומת החשיפה.
       9. לאחר שכל המטרות מצולמות, עבור אל צומת Exposure_Targeting כדי לראות את תמונת החור הבאה. בהגדרות , בטל את הסימון של אפשר אימות משתמש של יעדים נבחרים. כמו כן, בטל את הסימון של יעדי תור ודלג על מאתר חורים אוטומטי. לחץ על אישור ולחץ על שלח יעדים.
          הערה: Leginon תאסוף תמונות באופן אוטומטי בהתבסס על ההגדרות שהוגדרו לעיל. ראה את התמונות והמטא-נתונים ב-Appion.
   14. ניתן לבצע שינויים במהלך הגבייה האוטומטית. לדוגמה, שנה את טווח ביטול המיקוד של האוסף בכל עת על-ידי עריכת קביעת enn המוגדרת מראש Preset_Manager.
   15. אם יש צורך להפסיק את האיסוף, סיים את התור על-ידי לחיצה על הלחצנים בטל תור ותור ביטול בצמתים חור וחשיפה.
   16. לאחר סיום האוסף, עבור אל יישום ולחץ על הרוג, ולאחר מכן עבור אל קובץ ולחץ על יציאה.

2. שימוש במסך אוטומטי חכם של Leginon

1. יצירת הפעלת תבנית Smart Leginon
   1. בצע את ההוראות בסעיף 1 כדי להפעיל את Leginon.
   2. עבור אל יישום ולחץ על הפעל. בחלון הפעל יישום , בחר ביישום תלמי (בחר הצג הכל במידת הצורך). הגדר ראשי למחשב Leginon והיקף ומצלמה למחשב זה.
   3. Preset_Manager, ייבא קביעות מוגדרות מראש כמתואר בשלב 1.2.3.
   4. קביעת תצורה של הגדרות צומת.
      1. בהגדרות צומת Square_Targeting, ודא שהאפשרות מיין יעדים לפי הנתיב הקצר ביותר ואפשר פילוח אוטומטי מסומנת (איור משלים 1A).
      2. בהגדרות הצומת הריבוע, ודא שהאפשרות המתן עד שהצומת יעבד את התמונה מסומנת. הוסף את ההגדרה המוגדרת מראש של ריבוע לרשימה מימין מהתפריט הנפתח אם היא עדיין לא שם. בהגדרות מתקדמות, בדקו את הגדרת הצמצמים האלה בזמן ההדמיה וודאו שהערכים עבור שני הצמצמים נכונים (איור משלים 1B).
      3. בהגדרות צומת Hole_Targeting, סמן את אפשר אימות משתמש של יעדים נבחרים. בטל את הסימון של יעדי עמידה בתור ודלג על מאתר חורים אוטומטי (איור משלים 2A).
      4. בהגדרה ' צומת חור', סמן את האפשרות המתן עד שצומת יעבד את התמונה וקביעת החור המוגדרת מראש תופיע ברשימה מימין. בהגדרות מתקדמות, בדקו את הגדרת הצמצמים האלה בזמן ההדמיה וודאו שהערכים עבור שני הצמצמים נכונים (איור משלים 2B).
      5. בהגדרות צומת Exposure_Targeting, סמן את אפשר אימות משתמש של יעדים נבחרים. בטל את הסימון של יעדי עמידה בתור ודלג על מאתר חורים אוטומטי (איור משלים 3A).
      6. בהגדרות צומת החשיפה, ודא שהאפשרות המתן עד שצומת יעבד את התמונה אינה מסומנת, הקביעה המוגדרת מראש חשיפה מופיעה מימין, ובהגדרות מתקדמות, סמן את הגדר צמצמים אלה במהלך ההדמיה וודא שהערכים עבור שני הצמצמים נכונים (איור משלים 3B).
      7. בהגדרות צומת המיקוד, ודא שהאפשרות המתן עד שצומת יעבד את התמונה אינה מסומנת, שהגדרת המיקוד האוטומטי המוגדרת מראש מופיעה מימין, ודיוק המיקוד האוטומטי הרצוי מוגדר ל- 4 x 10-6 מ' (איור משלים 4A).
      8. ברצף המיקוד של צומת המיקוד (לצד לחצן ההגדרות), הפעל רק שני שלבים של מיקוד אוטומטי בהטיית הקרן (איור משלים 4B,C).
      9. בהגדרות הצומת Z_Focus, ודא שהאפשרות המתן עד שצומת יעבד את התמונה אינה מסומנת, שהגדרת החור המוגדרת מראש מופיעה מימין, ודיוק המיקוד האוטומטי הרצוי הוא 5 x 10-5 מ' (איור משלים 5A).
      10. ברצף המיקוד של צומת Z_Focus, הפעל רק שני שלבי הטיית שלב בהגדלה נמוכה (איור משלים 5B,C).
   5. קבע את גובה z של הרשת כמתואר בשלב 1.2.4.
   6. אסוף אטלס כמתואר בשלב 1.2.10.
   7. הגדר פרמטרים של מאתר ריבועים.
      1. לאחר איסוף האטלס, תלמי יאתר ריבועים בצומת Square_Targeting. כל ריבוע יציג עיגול כחול, שנקרא כתם. כאשר הוא מרחף מעל כל כתם, לגינון ידווח על גודלם כפי שחושב על ידי תלמי. שימו לב לכתמים הגדולים והקטנים ביותר.
      2. בהגדרות סף, שנה את טווח המסננים המינימלי והמרבי כך שיכלול ריבועים רצויים ולא יכלול ריבועים לא רצויים.
      3. לחצו על הלחצן 'חפש ריבועים' בסרגל הכלים העליון. התאם את טווח המסננים עד שהתכונה Find Squares תגיע ליעדים היטב.
      4. בהגדרות הרכישה, בחר ערכים עבור מספר היעד המרבי ומספר קבוצת היעד שיש לדגום. פרמטרים אלה יגדירו כמה ריבועים וקבוצות ריבועים ממוקדים.
      5. לאחר שהיית מרוצה מהפרמטרים, לחץ על לשחק לחצן. אטלס לדוגמה לאחר ההתקנה מוצג באיור משלים 6.
   8. הגדר פרמטרים של מאתר חורים.
      1. בצומת Hole_Targeting, השתמש בכלי סרגל למדידת קוטר חור.
      2. בהגדרות התבנית, הזן את הקוטר לקוטר התבנית הסופית ולחץ על בדוק. התאימו את הקוטר עד שלכל החורים יהיו פסגות לבנות בוהקות במרכז.
      3. בהגדרות הסף, לחץ על בדוק. התאימו את הערך A עד שהתמונה הבינארית תציג רק אזורים לבנים שבהם ממוקמים חורים.
      4. בהגדרות Blobs, בחר לא לכלול יעדי גבול באמצעות הסרגל כדי לקבוע מרחק מינימלי מהקצה ולהזין ערך זה. ניתן לסנן כתמים לפי גודלם, מעוגלותם ומספרם הרצוי. רחף מעל כתמים כדי להציג את הערכים שלהם. לחץ על Test כדי לבדוק את הערכים הנוכחיים.
      5. בהגדרות הסריג, הזינו את רדיוס החורים ואת המרווח בין החורים (השתמשו בכלי המדידה) ולאחר מכן לחצו על הלחצן 42 למדידת ערך עוצמת הייחוס של אזור ואקום (חור ריק או סרט תמיכה שבור).
      6. בהגדרות הרכישה, סמן את השתמש בקבוצת משנה של יעדי הרכישה והגדר את הערך המרבי לדוגמה למספר קטן, כגון 2. הגדר טווח רחב של אמצעי עובי קרח וסטיות תקן (מדוד ערכים אלה על ידי ריחוף מעל מטרות). לחץ על Test targeting כדי לבצע אקראיזציה של בחירת היעד בהינתן הערכים לעיל.
      7. לחץ על לשחק כפתור כאשר אתה מרוצה מכל ההגדרות. לגינון יבצע Z_Focus שלב ויאסוף את המטרה הראשונה. תמונה לדוגמה לאחר ההגדרה מוצגת באיור משלים 7.
   9. הגדר פרמטרים לפילוח חשיפה.
      1. בהגדרות החור, הגדר את Shell Script לנתיב הסקריפט hl_finding.sh בהתקנה של תלמי. הגדר את הציון המינימלי לקבל להיות ≤0. הזינו את רדיוס החורים (השתמשו בכלי המדידה) ולאחר מכן לחצו על כפתור 42 למדידת ערך עוצמת הייחוס של אזור ואקום (חור ריק או סרט תמיכה שבור). לחץ על בדוק כדי למצוא את סריג החורים.
      2. בהגדרות רכישה, סמן את השתמש בקבוצת משנה של יעדי הרכישה והגדר את הערך המרבי לדוגמה למספר קטן, כגון 4, כדי לאסוף על קבוצת משנה של חורים לצורך סינון. הגדר טווח רחב של אמצעי עובי קרח וסטיות תקן (מדוד ערכים אלה על ידי ריחוף מעל מטרות).
      3. לחץ על לשחק כפתור כאשר אתה מרוצה מכל ההגדרות. לגינון יבצע פוקוס אאוצנטרי ויאסוף תמונות בהגדלה גבוהה, אותן ניתן לראות בצומת החשיפה . תמונה לדוגמה לאחר ההגדרה מוצגת באיור משלים 8.
   10. בדוק את תמונת Exposure_Targeting הבאה כדי לראות אם ההגדרות לעיל עדיין מספיקות. לאחר שביעות רצון, בטל את הסימון באפשרות אפשר אימות משתמש של יעדים נבחרים בהגדרות מיקוד חשיפה ומיקוד חורים.
       הערה: ההקרנה אמורה לפעול כעת ללא השגחה עבור הרשת הנוכחית. הפעלה זו תשמש כהפעלת התבנית עבור כל הרשתות.
2. לאחר סיום הקרנת הרשת, לחץ על קובץ > יציאה כדי לסגור את Leginon.
3. הגדרת מסך אוטומטי חכם של Leginon
   1. בחלון טרמינל, בצעו את autoscreen.py Smart Leginon.
   2. בחר gui, הזן רשימה מופרדת באמצעות פסיקים של חריצי רשת למסך, הזן מלא עבור זרימת העבודה, הזן את שם הפעלת התבנית כדי לבסס עליה הפעלות חדשות (ניתן למצוא זאת ב- Appion imageviewer) והזן את ערך גובה z של הפעלת התבנית (איור משלים 9).
   3. ממשק משתמש גרפי ייפתח כדי לאפשר להזין את שם ההפעלה עבור כל רשת ולבחור את שיוכי הפרוייקט המתאימים (איור משלים 10).
      הערה: המסך האוטומטי Smart Leginon ישתמש כעת בהגדרות הפעלת התבנית כדי לסנן באופן אוטומטי כל רשת ולעבור בין רשתות ללא השגחה.
   4. עקבו אחר האוסף בלגינון, אפיון ומחשב המיקרוסקופ, או השאירו את המיקרוסקופ ללא השגחה כלל.
      הערה: לאחר סינון כל הרשתות, Smart Leginon יסגור את שסתומי העמודים במיקרוסקופ.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הצינור עבור מסך אוטומטי חכם Leginon, ובנוסף שימוש בסיסי Leginon עבור אלה חדשים בתוכנת האוסף. cryoEM של חלקיק יחיד עומד להפוך לטכניקה הפרודוקטיבית ביותר לפתרון מבנה חלבון תלת מימדי (3D) עד סוף 2024¹⁷. צינור cryoEM של חלקיק יחיד מורכב ממספר שלבים הממוטבים כל הזמן כדי להגדיל את איכות הנתונים והתפוקה. איור 2 מראה את השלבים הנפוצים ביותר (הכנת דגימה, הכנת רשת, זמן סינון ומאמץ, זמן איסוף ברזולוציה גבוהה, עיבוד חי ועיבוד מלא לאחר עיבוד) יחד עם רכיבים אחרים של הצינור שניתן לשפר (גישה למיקרוסקופ סינון, מהירות ודיוק במה, מהירות מצלמה וגישה למיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה). התוצאות מרוב השלבים הופכות ללולאות משוב לשלבים קודמים (חיצים כחולים באיור 2), מה שהופך את הצינור כולו לתלוי מאוד זה בזה. כל צעד באיור 2 צבוע כדי להעריך עד כמה צוואר בקבוק הוא הצעד ביחס לאחרים. מסך אוטומטי חכם של Leginon מפחית באופן משמעותי את הזמן והמאמץ של המפעיל לסינון 12 רשתות מ-6 שעות לפחות מ-10 דקות, ובכך מקל על צוואר בקבוק זה ומאפשר משוב מהיר יותר להכנת הדגימה/הרשת (איור 3).

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, המתוארים באיור 1. חשוב מאוד שהרשת המשמשת ליצירת הפעלת התבנית תייצג את שאר הרשתות שיש לסנן. חשוב לציין, Leginon זוכר את כל ההגדרות בכל תהליך ההגדרה ליצירת הפעלת תבנית (שלבים כחולים באיור 1), מה שמאפשר להגדיר הפעלות תבנית חוזרות במהירות רבה יותר בכל פעם. בשעת יצירת הפעלת תבנית, השלב הקריטי ביותר הוא הגדרת פילוח בכל ההגדלות, כך שהפרמטרים וערכי הסף ישקפו את השונות הצפויה בין הרשתות שיש לסנן. כפתורי ה'בדיקה' השונים מאפשרים יעילות בתהליך הגדרה זה. במהלך הפעלת מסך אוטומטי, קריטי לנטר את הרשתות הראשונות ב- Appion כדי לזהות במהירות בעיות ולתקן אותן בתוך Leginon בהקדם האפשרי.

זרימת העבודה הטיפוסית ב- SEMC היא להזין נתוני מסך אוטומטי לתוך CryoSPARC Live¹⁸ ולהשתמש במידע נוסף זה כדי ליידע את לולאות המשוב בהכנת הדגימה/רשת. במהלך ימי אופטימיזציה אינטנסיביים של cryoEM על ידי חוקר-מפעיל, מידע על הדגימה ותנאי הרשת מוזן בחזרה להכנת הדגימה והרשת בזמן שהמסך האוטומטי עדיין מסנן רשתות. זה מאפשר כמה עשרות רשתות להיות קפוא והקרנה בשבוע⁸.

מסך אוטומטי חכם של Leginon פועל עבור רוב (80%-90%) של רשתות חורים ותנאים שנצפו ב- SEMC. 10%-20% הנותרים של הרשתות כוללים את אלה שלפעמים לא עובדות טוב - רשתות עם הפרש ניגודיות מינימלי בין חורים למצע; רשתות עם חורים ומרווחים קטנים יותר (למשל, 0.6/0.8) - ורשתות שבהן מיקוד על פני רשתות מרובות הוא לעתים קרובות לא מעשי - רשתות Spotiton/Chameleon^19,20 המורכבות מפסים של דגימה על פני הרשת; רשתות לייסי. שים לב שאוסף הרשת המוטה עם המסך האוטומטי נמצא בפיתוח אך עדיין אינו זמין. ייתכן שניתן יהיה לשנות את הפרוטוקול כך שיעבוד עם רשתות Spotiton/Chameleon על ידי הדמיה ראשונית של אזורים של הפס באופן ידני כדי לקבוע ספי פרמטרים צרים, ולאחר מכן לנסות לקבץ ריבועים גדולים וקטנים יותר יחד, בהתאמה, בשלב 2.1.7.4, ולאחר מכן לבחור מטרות מהקבוצה עם קרח. מטרת השינוי היא לגרום ללגינון חכם להפריד ריבועים ריקים ולא ריקים לשתי קבוצות. אם נמצאו פרמטרים, ייתכן שהם לא יתרחבו היטב לרשתות הנותרות שיש לסנן. ייתכן שניתן יהיה גם לשנות את הפרוטוקול כך שיעבוד עם רשתות תחרה על ידי הסרת סקריפט hl_finding.sh בשלב 2.1.9.1 והגדרת הפרמטרים כך שיתמקדו באזורים בהירים/כהים יותר כרצונך. שיעור ההצלחה של שינוי זה עשוי להשתנות מרשת לרשת בהתבסס על עובי הקרח וחומר הרשת.

פתרון בעיות במהלך הפעלת מסך אוטומטי אפשרי ולעתים מתאים. ניתן לבצע שינויים בפרמטרים מוגדרים מראש (למשל, ביטול מיקוד) ובפרמטרים של מיקוד (לדוגמה, ספי מיקוד חורים) במהלך איסוף אוטומטי. בעת איסוף הפעלת מסך אוטומטי, לא ניתן לבטל הפעלת רשת מכיוון שהיא תסתיים autoscreen.py. עם זאת, ניתן להשתמש בלחצני הביטול בצמתי היעד כדי לדלג על חלק כלשהו ברשת או על רשת שלמה. לעיתים, autoscreen.py עשויים להשתמש ביותר מדי זיכרון ולקפוא, ולהציע שתי אפשרויות: "לאלץ הפסקה" או "לחכות". אם נבחרה האפשרות 'כפה יציאה', הסקריפט כולו יסתיים, והמשתמש יחייב את המשתמש להפעיל מחדש את הסקריפט שיוחל על הרשתות הנותרות לצורך סינון. אם נבחרה האפשרות 'המתן', הסקריפט יימשך, וההגדרות עשויות להשתנות כדי למנוע קיפאון עתידי, לדוגמה, כיבוי תצוגת התמונה בצומת חשיפה, הקטנת גודל הפיקסלים באטלס או הפעלת סקריפט נקי מהזיכרון. אם התוכנית קופאת מבלי להציע את שתי האפשרויות, ייתכן ששגיאות זיכרון לא ייפתרו מעצמן, ויגרמו להפסקה ברכישה. האפשרות 'כפה יציאה' עשויה להיות שימושית במקרה זה.

מסך אוטומטי חכם Leginon נמצא בשימוש קבוע ב- SEMC. ככל שצווארי בקבוק בצנרת cryoEM של חלקיק יחיד ממשיכים להיות מופחתים, אימוץ cryoEM ימשיך לגדול כדי לעזור לענות על שאלות ביולוגיות. פרוטוקול זה הוא צעד בכיוון של אופטימיזציה של הצינור כולו על ידי מתן נתיב ברור להפחתה משמעותית של לולאות משוב.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacios cryoTEM	Thermo Fisher Scientific	GLACIOSTEM	FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera
Krios cryoTEM	Thermo Fisher Scientific	KRIOSG4TEM	XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera
Leginon	Simons Electron Microscopy Center		http://leginon.org
Ptolemy	Simons Machine Learning Center		https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy