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Summary

A triagem multigrade da microscopia crioeletrônica (cryoEM) é muitas vezes um processo tedioso que demanda horas de atenção. Este protocolo mostra como configurar uma coleção Leginon padrão e Smart Leginon Autoscreen para automatizar esse processo. Este protocolo pode ser aplicado à maioria das grades de folha de holey cryoEM.

Abstract

Os avanços nas técnicas de microscopia crioeletrônica (crioEM) na última década permitiram que biólogos estruturais resolvessem rotineiramente complexos de proteínas macromoleculares com resolução quase atômica. O fluxo de trabalho geral de todo o pipeline cryoEM envolve a iteração entre a preparação da amostra, a preparação da grade do cryoEM e a triagem da amostra/grade antes de passar para a coleta de dados de alta resolução. A iteração entre a preparação da amostra/grade e a triagem é tipicamente um grande gargalo para os pesquisadores, pois cada experimento iterativo deve ser otimizado para concentração da amostra, condições de tampão, material da grade, tamanho do furo da grade, espessura do gelo e comportamento das partículas de proteína no gelo, entre outras variáveis. Além disso, uma vez que essas variáveis são determinadas satisfatoriamente, as grades preparadas sob condições idênticas variam amplamente se estão prontas para a coleta de dados, portanto, sessões de triagem adicionais antes da seleção de grades ideais para coleta de dados de alta resolução são recomendadas. Este processo de preparação e triagem de amostras/grades geralmente consome várias dezenas de grades e dias de tempo do operador no microscópio. Além disso, o processo de triagem é limitado à disponibilidade do operador/microscópio e à acessibilidade ao microscópio. Aqui, demonstramos como usar o Leginon e o Smart Leginon Autoscreen para automatizar a maioria das peneiras de grade crioEM. O Autoscreen combina aprendizado de máquina, algoritmos de visão computacional e algoritmos de manuseio de microscópio para eliminar a necessidade de entrada manual constante do operador. A tela automática pode carregar e criar imagens de grades de forma autônoma com imagens em várias escalas usando um sistema automatizado de de troca de amostras, resultando em triagem de grade autônoma para um inteiro. Como resultado, o tempo do operador para a triagem de 12 grades pode ser reduzido para ~10 min com o Autoscreen em comparação com ~6 h usando métodos anteriores que são prejudicados por sua incapacidade de explicar a alta variabilidade entre grades. Esse protocolo primeiro introduz a configuração e a funcionalidade básicas do Leginon e, em seguida, demonstra a funcionalidade do Autoscreen passo a passo, desde a criação de uma sessão de modelo até o final de uma sessão de triagem automatizada de 12 grades.

Introduction

A microscopia crio-eletrônica de partícula única (cryoEM) permite a determinação da estrutura de resolução quase atômica de complexos macromoleculares purificados. Um experimento crioEM de uma única partícula requer apenas uma ou duas grades bem escolhidas selecionadas de um conjunto muito maior de grades com condições variadas de amostra e grade. A triagem ao microscópio para examinar essas grades envolve a obtenção de imagens de cada grade em várias ampliações para determinar qual grade satisfaz a maioria dos requisitos essenciais para a coleta de dados de alta resolução, incluindo espessura do gelo, áreas suficientes para a coleta completa de dados, pureza da proteína, concentração de proteína, estabilidade da proteína e questões mínimas de orientação preferencial1. A otimização para esses requisitos-chave geralmente envolve feedback entre a triagem no microscópio e as condições de preparação, como produção de proteínas, seleção de tampão, detergentes potenciais e tipode grade 2,3,4 (Figura 1). A triagem convencional da grade é realizada manualmente ou semi-manualmente com softwares como Leginon5, SerialEM6 e EPU7. A triagem convencional requer que o operador do microscópio passe horas no microscópio para filtrar várias grades, o que cria um gargalo significativo no fluxo de trabalho de partícula única de alta resolução, ocupando o operador com operações rotativas em vez de otimização de amostra/grade.

Anteriormente, o Smart Leginon Autoscreen e o software de aprendizado de máquina subjacente, Ptolomeu, foram introduzidos, e seus métodos e algoritmos subjacentes, juntamente com exemplos, foram descritos 8,9. Vários outros pacotes de software são capazes ou trabalham para a triagem multi-grid totalmente automatizada10, incluindo SmartScope11, Smart EPU12 e CryoRL13,14. Para resolver o gargalo de triagem, o Smart Leginon permite que o usuário primeiro configure os parâmetros de triagem em uma sessão de microscópio de modelo e, em seguida, use os parâmetros dessa sessão de modelo como um modelo para examinar o completo de grades no carregador automático do microscópio. Todo o trabalho manual durante a triagem do é eliminado, o que permite que o ciclo de feedback de otimização prossiga de forma significativamente mais eficiente.

Neste protocolo, o fluxo de trabalho completo do Smart Leginon Autoscreen é descrito para que o leitor possa executar a triagem crioEM multi-grid totalmente automatizada de forma independente. Para aqueles novos no Leginon, a primeira seção do protocolo descreve o uso convencional do Leginon . Esse conhecimento é composto por vários anos de experiência em vários microscópios de carregador automático, que é então construído na seção Smart Leginon subsequente do protocolo. Vídeos tutoriais adicionais podem ser encontrados em https://memc.nysbc.org.

Protocol

Para seguir esse protocolo, representado na Figura 2, o Leginon 3.6+ precisa ser instalado no computador microscópio e em uma estação de trabalho Linux adicional, e o Ptolomeu precisa ser instalado na estação de trabalho Linux. Este protocolo foi desenvolvido ao longo de vários anos usando microscópios Thermo Fisher Scientific (TFS) Glacios e Krios. Este protocolo assume que o leitor já configurou o Leginon, o Appion15, o banco de dados associado, calibrações do microscópio, realizou alinhamentos diretos no microscópio e estabeleceu duas Aplicações Leginon: uma para coleta padrão de partículas únicas e outra para coleta de partículas únicas com Ptolomeu. Informações para a criação do Leginon estão disponíveis aqui: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual. Informações para a criação de Ptolomeu dentro do Leginon estão disponíveis aqui: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening. Baixe Leginon de http://leginon.org e Ptolomeu de https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy. A Leginon está licenciada sob a Licença Apache, Versão 2.0, e a Ptolomeu está licenciada sob a CC BY-NC 4.0.

1. Uso de Leginon

  1. Iniciar Leginon
    1. No microscópio do computador Windows, feche todos os clientes Leginon e abra-o novamente. Na estação de trabalho Linux, abra uma janela de terminal e digite start-leginon.py ou o alias apropriado do sistema para iniciar o Leginon.
    2. Na nova janela Configuração do Leginon , selecione Criar uma nova sessão e clique em Avançar.
    3. Selecione o projeto na lista suspensa e clique em Avançar.
    4. Deixe o Nome como está, selecione o suporte correto para a configuração do microscópio e clique em Avançar.
    5. Para obter a descrição, insira informações relevantes, como o nome do microscópio, a descrição da grade/amostra e a descrição do experimento, e clique em Avançar.
    6. Para o diretório de imagem, verifique se o sistema de arquivos apropriado está selecionado e se o caminho completo é apropriado para salvar imagens e clique em Avançar.
    7. Em Conectar a clientes, clique em Editar. No menu suspenso, selecione todos os computadores que devem ser conectados e clique no botão + para cada um e, em seguida, clique em OK e Avançar.
    8. Insira o tamanho correto da abertura C2 e clique em Avançar. Esse valor pode ser encontrado na guia Aberturas do software TFS TUI.
  2. Interface Leginon
    1. Selecione Aplicativo na barra de ferramentas e clique em Executar.
    2. Selecione o aplicativo apropriado no menu suspenso (clique em Mostrar tudo , se necessário). Defina principal para o computador Leginon e escopo e câmera para esse respectivo computador e, em seguida, clique em Executar. O lado esquerdo da janela principal do Leginon será preenchido com nós.
      Observação : o painel esquerdo mostra todos os nós Leginon . Os nós do ícone verde da câmera são as imagens que serão salvas: Grade, Quadrado, Buraco e Exposição. Os nós com o sinal de destino são imagens de menor ampliação para direcionar as imagens de maior ampliação. Os nós roxos da câmera são os nós que são programados para encontrar a altura z eucêntrica e o foco eucêntrico. Além disso, há nós para alinhar o pico de perda zero, monitorar o ciclo do buffer, monitorar o enchimento de nitrogênio líquido, coletar imagens de correção de ganho, calcular a espessura do gelo (IceT) e navegar na grade através de diferentes ampliações usando mudança de estágio e imagem.
    3. Gerenciador de predefinições
      1. Clique no nó Presets_Manager. Nesse nó, clique no ícone inferior para importar predefinições ou no ícone acima desse para criar uma nova predefinição a partir do estado atual do microscópio.
      2. Se o ícone inferior for clicado, uma janela Importar predefinições será aberta. Selecione o MET e a câmera digital corretos, clique em Localizar e selecione a sessão mais recente com as predefinições desejadas. Realce todas as predefinições desejadas e clique em Importar e, em seguida, clique em Concluído.
        Observação : o nó Gerenciador de predefinições agora deve listar todas as predefinições importadas e criadas. Recomenda-se ter predefinições para várias ampliações e foco, incluindo gr: Ampliação de grade, sq: Ampliação de quadrado, hln: Ampliação de furo, ventilador: Foco automático, fcn: Foco central, enn: Ampliação de exposição ('n' refere-se a nanossonda). Os parâmetros predefinidos típicos para cada ampliação são mostrados na Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3. Note que este protocolo usa um tamanho de abertura C2 de 70 μm para os Glacios, 50 μm para os Krios com um Selectris X e Falcon 4i, e 100 μm para os Krios com um BioQuantum com um K3.
    4. Navegação e altura eucêntrica
      1. Para se familiarizar com o controle do microscópio através do Leginon e definir a altura z da grade, vá para o nó Navegação, selecione a predefinição gr na parte superior e clique na seta vermelha à direita para enviar as configurações predefinidas para o microscópio. O microscópio deve atualizar após 1-2 s. Uma vez atualizado, clique no botão da câmera à direita para adquirir uma imagem.
      2. Usando a ferramenta de cursor, selecione um quadrado de grade para onde mover o palco. Clique na ampliação do sq e, em seguida, na seta vermelha para enviar ao microscópio e clique no botão da câmera para adquirir uma imagem.
      3. Vá para o nó Z_Focus e clique no botão Simular Destino na parte superior, perto do meio dos botões. Enquanto as imagens estão sendo coletadas para foco de inclinação do palco, alterne para o modo de exibição de correlação e observe o pico para garantir que ele esteja no canto da imagem de correlação. Quando o foco estiver concluído, certifique-se de que o palco esteja definido para a altura z da grade.
    5. Correção do coma
      NOTA: Esta subseção pressupõe que os alinhamentos diretos já foram realizados e que as correções de coma não foram executadas.
      1. Navegue até uma área da grade que produza anéis Thon claros, como substrato de carbono.
        NOTA: Uma grade cruzada pode ser usada se a coleta for feita em uma grade de ouro.
      2. Nas configurações Beam_Tilt_Image, verifique se a Ordem de predefinições inclui apenas fcn com quatro direções de inclinação em um ângulo de 0,005 radianos.
      3. Clique em Simular destino para criar um quadro Zemlin. Clique em Tableau no lado esquerdo da janela principal para visualizar o quadro.
      4. Corrija o coma comparando as transformações de Fourier esquerda e direita entre si e as transformadas de Fourier superior e inferior entre si. Se os pares de imagens não forem idênticos, primeiro clique no ícone do cursor à direita dos ajustes de imagem, depois clique ligeiramente fora do centro na imagem do Tableau na direção da diferença e aguarde a coleta de um novo conjunto de transformações de Fourier. Repita até que as transformadas de Fourier sejam idênticas.
        NOTA: cada clique do Tableau leva vários segundos para ser concluído, e nenhum clique adicional deve ser feito durante esse período.
    6. Ganhe referências
      NOTA: ignore esta seção se a câmera tiver referências automáticas de hardware.
      1. No nó Navegação, envie uma predefinição de baixa ampliação, como gr, e navegue até uma área onde não haja obstrução ao caminho do feixe.
      2. Confirme se a posição do estágio está em um local não obstruído pelo caminho do feixe obtendo uma imagem de ampliação média usando a predefinição sq ou hln .
      3. Envie a predefinição enn de alta ampliação para o microscópio.
      4. Nas configurações do nó Correção, selecione as informações adequadas do Instrumento e configure a Configuração da câmera para corresponder às configurações da coleção.
      5. Colete uma imagem de referência escura fechando as válvulas de coluna no microscópio e, em seguida, no nó Correção, selecione Escuro e Ambos os canais nos menus suspensos na parte superior e clique no botão Adquirir câmera à direita.
      6. Depois de concluído, selecione Brilhante no menu suspenso e clique em Adquirir. Leginon abrirá as válvulas da coluna automaticamente.
      7. Verifique se o ganho foi coletado corretamente selecionando Corrigido no menu suspenso, clicando em Adquirir e observando a imagem resultante.
    7. Imagem de referência da espessura do gelo
      1. Se o microscópio tiver um filtro de energia, nas configurações do nó IceT, marque Coletar imagem de espessura de gelo, insira 395 para o caminho livre médio e preencha o restante dos valores para a configuração.
      2. Se o microscópio não tiver um filtro de energia, no nó Navegação, envie a predefinição enn para o microscópio e clique em Adquirir. Anote o valor de pixel médio no lado esquerdo. Nas configurações do nó IceT, marque Calcular espessura de gelo a partir de dispersão limitada de abertura, insira 1055 para o coeficiente ALS e o valor médio de pixel medido.
        NOTA: Os valores 395 e 1055 foram determinados para o TFS Krios e Glacios, respectivamente, conforme descrito anteriormente16, e podem precisar ser recalibrados para diferentes configurações de microscópio.
    8. Calibração da dose de imagem
      1. No Preset_Manager, selecione a predefinição enn e clique no botão da câmera (Adquirir imagem de dose para a predefinição selecionada). Verifique a dose medida na parte inferior. Se estiver próximo do valor esperado (normalmente entre 30 e 70), clique em SIM.
    9. Alinhamentos predefinidos
      1. No Preset_Manager, verifique todas as predefinições de alta ampliação (enn, fcn e fan) para garantir que o deslocamento da imagem e o deslocamento do feixe sejam 0, 0.
      2. No computador do microscópio, navegue até uma área de carbono.
      3. No computador Leginon no nó Navegação, adquira uma imagem com a predefinição gr .
      4. Encontre um objeto de interesse e vá para esse local usando a ferramenta de cursor.
      5. Adquira uma imagem com a predefinição hln e realoque uma parte exclusiva desse objeto de interesse para o centro usando a ferramenta de cursor.
      6. Adquira uma imagem com a predefinição enn e realoque-a para a mesma parte exclusiva do objeto de interesse usando a ferramenta de cursor.
      7. Selecione a mudança de imagem no menu suspenso e adquira uma imagem com a predefinição hln. Realoque para a mesma parte exclusiva do objeto de interesse com a ferramenta de cursor.
      8. No Presets_Manager, selecione a predefinição hln , clique no botão settings e importe a mudança de imagem de Navegação clicando na seta verde para a esquerda ao lado dos valores de deslocamento de imagem .
      9. Repita as etapas 2.9.7 e 2.9.8 para as predefinições sq e gr .
    10. Atlas de grade
      1. No computador do microscópio, feche as válvulas da coluna e retraia a abertura objetiva. Vá para o nó Grid_Targeting. Em configurações, altere o rótulo da grade. Escolha o raio desejado do atlas (o raio máximo é de 0,0009 m). Clique em OK. Em seguida, clique no botão Calcular calculadora de atlas na parte superior e clique no botão verde Reproduzir ('Enviar Destinos').
      2. No nó Square_Targeting, as imagens da grade serão coletadas e costuradas para formar um atlas. Aumente e diminua o zoom usando o menu suspenso e ajuste o contraste e o brilho. Use as barras de rolagem para se mover pela grade.
      3. Uma vez que o atlas é coletado, insira a abertura objetiva, se desejado.
      4. Se o microscópio tiver um filtro de energia, selecione um alvo de referência no centro de um quadrado quebrado, pressione o botão Reproduzir e prossiga com o alinhamento ZLP na subseção a seguir. Caso contrário, ignore a etapa de alinhamento ZLP.
    11. Alinhamento ZLP
      1. Nas configurações do nó Align_ZLP, selecione estágio position para mover o destino de referência e selecione gerenciador predefinido como o movimentador. Desmarque o condicionador de bypass e pressione OK.
        NOTA: O alinhamento ZLP agora deve ser configurado para que o microscópio se mova periodicamente para o alvo de referência e execute a rotina de alinhamento ZLP da câmera. Tempos de realinhamento ZLP de 30 min e 60 min são tipicamente seguros para filtros de energia Gatan BioQuantum e TFS Selectris X, respectivamente. Esses valores variam dependendo das condições do filtro de energia, incluindo umidade consistente, temperatura consistente, isolamento de campo eletromagnético e isolamento de vibração.
    12. Configuração de segmentação de modelo de furo
      1. No nó Square_Targeting, selecione vários destinos de aquisição e pressione Reproduzir.
      2. Nas configurações do nó Hole_Targeting, verifique se a opção Permitir verificação do usuário dos destinos selecionados e Aumentar a fila está marcada. Além disso, verifique Ignorar localizador de furos automatizado por enquanto. Clique em Aplicar e, em seguida, em OK.
      3. Na janela principal, use Ctrl-Shift-clique direito para remover todos os destinos. Selecione o cursor de aquisição e coloque os destinos. Selecione o cursor de foco e coloque um alvo de foco entre os destinos de aquisição. Clique em Reproduzir.
      4. Para a próxima imagem Hole_Targeting , desmarque a opção Ignorar localizador automático de furos nas configurações e clique em Aplicar e OK. Remova os destinos automáticos com Ctrl-Shift-clique com o botão direito do mouse.
      5. Selecione a ferramenta de régua e meça o diâmetro em um furo. Em Configurações do modelo, altere o diâmetro do modelo final para o diâmetro do furo medido. Não altere o diâmetro do modelo original. Clique em Testar. Se os picos brilhantes não estiverem no centro de cada buraco, aumente o Diâmetro Final do Modelo. Quando terminar, clique em OK.
      6. Nas configurações de Limite, escolha um valor para A que segmente os orifícios individualmente quando Testar for clicado. Clique em OK quando estiver satisfeito.
      7. Nas configurações de Blobs, insira os valores e clique em Testar. O valor de blobs Max é 1, portanto, apenas um blob aparece. Clique em OK.
      8. Em Configurações de rede, use a ferramenta de régua para medir a distância entre dois orifícios (centro a centro). Insira o valor em Espaçamento e clique em Testar. O único blob se transformará em um ponto de treliça. Clique em OK.
      9. Vá para as configurações de aquisição e otimize os alvos de aquisição usando limites de espessura de gelo e o botão Testar segmentação. Obtenha informações sobre a espessura do gelo passando o mouse sobre os pontos de treliça.
      10. Se os alvos de aquisição não forem satisfatórios, use a ferramenta de régua para medir a distância e o ângulo do ponto de rede até o local desejado para um alvo de aquisição. Exclua os pontos do Modelo de Destino de Aquisição anterior. Clique em Preenchimento automático, coloque 4 para o número de alvos e altere o raio e o ângulo para os valores medidos. Clique em OK. Marque Aplicar limite de espessura de gelo em alvos de aquisição com envolvimento de modelo.
      11. Quando estiver satisfeito com os pontos de rede e os limites de espessura de gelo, clique no botão Enviar destinos .
      12. Repita qualquer uma das etapas acima, conforme necessário, para cada quadrado selecionado. Envie toda a fila com o botão Enviar destinos em fila depois que todos os destinos quadrados forem enviados.
      13. Leginon começará a focar e criar imagens de cada conjunto de alvos. No nó Z_Focus, certifique-se de que a altura eucêntrica seja encontrada corretamente.
    13. Configuração de segmentação de modelo de exposição
      1. No nó Direcionamento de exposição, serão exibidas imagens de ampliação de orifício. Use Ctrl-Shift-clique com a tecla direita para remover os destinos automáticos.
      2. Meça o diâmetro de um furo com a ferramenta de régua. Nas configurações do modelo, insira o diâmetro no diâmetro do modelo final e clique em Testar. Um pico deve estar agora no centro de cada buraco. Ajuste os valores de diâmetro , se necessário.
      3. Nas configurações de Limite, ajuste o valor A até que a imagem de teste binarizada mostre áreas brancas somente onde os buracos estão localizados.
      4. Nas configurações de Blobs, clique em Testar. Um blob por furo segmentado deve aparecer. Aumente a Borda para remover os blobs das bordas da imagem, se desejado.
      5. Nas configurações de rede, clique em Testar. Ajuste os parâmetros até que todos os blobs tenham se transformado em pontos de rede. Clique em OK.
      6. Clique na ferramenta de régua e meça a distância entre dois pontos de treliça. Nas configurações de rede, altere Espaçamento para essa distância.
      7. Passe o mouse sobre cada ponto da rede para ver a intensidade média, a espessura média, a intensidade do desvio padrão e a espessura do desvio padrão. Anote as intensidades para cada ponto de rede e use-as para definir os parâmetros de espessura de gelo desejados nas configurações de aquisição.
      8. Meça a distância e o ângulo de um ponto de rede até o centro de 4 furos com a ferramenta de régua. Nas configurações de aquisição, exclua os destinos de foco atuais. Clique em Preenchimento Automático e altere o raio e o ângulo para os valores medidos. Clique em Testar segmentação, clique em OK e clique em Enviar destinos.
        NOTA: O Leginon encontrará o foco eucêntrico (nó Foco) e coletará exposições, que aparecerão no nó Exposição.
      9. Depois que todos os alvos forem fotografados, vá para o nó Exposure_Targeting para ver a próxima imagem do buraco. Nas configurações, desmarque Permitir para verificação do usuário dos destinos selecionados. Além disso, desmarque Queue up targets e Skip automated hole finder. Clique em OK e clique em Enviar destinos.
        NOTA: O Leginon coletará automaticamente imagens com base nas configurações definidas acima. Veja as imagens e metadados no Appion.
    14. As alterações podem ser feitas durante a coleta automatizada. Por exemplo, altere o intervalo de desfoco da coleção a qualquer momento editando a predefinição enn no Preset_Manager.
    15. Se a coleta precisar ser interrompida, encerre a fila clicando nos botões Anular e Anular Fila nos nós Furo e Exposição.
    16. Quando a coleção estiver concluída, vá para Aplicativo e clique em Matar, depois vá para Arquivo e clique em Sair.

2. Uso inteligente do Leginon Autoscreen

  1. Criar uma sessão Smart Leginon Template
    1. Siga as instruções na Seção 1 para iniciar o Leginon.
    2. Vá para Aplicativo e clique em Executar. Na janela Executar Aplicativo , selecione o Aplicativo de Ptolomeu (selecione Mostrar Tudo , se necessário). Defina principal para o computador Leginon e escopo e câmera para esse respectivo computador.
    3. No Preset_Manager, importe predefinições conforme descrito na etapa 1.2.3.
    4. Definir configurações de nó.
      1. Nas configurações do nó Square_Targeting, verifique se a opção Classificar destinos pelo caminho mais curto e Habilitar segmentação automática está marcada (Figura 1A suplementar).
      2. Nas configurações do nó quadrado, verifique se a opção Esperar que o nó processe a imagem esteja marcada. Adicione a predefinição Square à lista à direita no menu suspenso, se ainda não estiver lá. Em Configurações avançadas, verifique se essas aberturas são definidas durante a criação de imagens e se os valores das duas aberturas estão corretos (Figura 1B suplementar).
      3. Nas configurações do nó Hole_Targeting, marque Permitir a verificação do usuário dos destinos selecionados. Desmarque Queue up targets e Skip automated hole finder (Figura 2A suplementar).
      4. Na configuração do nó Hole, marque Esperar que um nó processe a imagem e a predefinição Hole está na lista à direita. Em Configurações avançadas, verifique se essas aberturas são definidas durante a criação de imagens e se os valores das duas aberturas estão corretos (Figura 2B suplementar).
      5. Nas configurações do nó Exposure_Targeting, marque Permitir para verificação do usuário dos destinos selecionados. Desmarque Queue up targets e Skip automated hole finder (Figura 3A suplementar).
      6. Nas configurações do nó Exposição, verifique se a opção Esperar que um nó processe a imagem esteja desmarcada, se a predefinição Exposição estiver listada à direita e, em Configurações avançadas, marque definir essas aberturas durante a criação de imagens e verifique se os valores das duas aberturas estão corretos (Figura 3B Suplementar).
      7. Nas configurações do nó Foco, verifique se a opção Esperar que um nó processe a imagem esteja desmarcada, a predefinição de foco automático esteja listada à direita e a precisão de foco automático desejada esteja definida como 4 x 10-6 m (Figura 4A Suplementar).
      8. Na Sequência de foco do nó Foco (ao lado do botão de configurações), habilite apenas duas etapas de foco automático de inclinação do feixe (Figura 4B,C suplementar).
      9. Nas configurações do nó Z_Focus, certifique-se de que a opção Esperar que um nó processe a imagem esteja desmarcada, que a predefinição Furo esteja listada à direita e que a precisão de foco automático desejada seja de 5 x 10-5 m (Figura Suplementar 5A).
      10. Na Sequência de foco do nó Z_Focus, habilite apenas duas etapas de inclinação do estágio de baixa ampliação (Figura Suplementar 5B,C).
    5. Determine a altura z da grelha conforme descrito no passo 1.2.4.
    6. Colete um atlas conforme descrito na etapa 1.2.10.
    7. Configure os parâmetros do localizador quadrado.
      1. Uma vez que o atlas tenha sido coletado, Ptolomeu localizará quadrados no nó Square_Targeting. Cada quadrado mostrará um círculo azul, chamado de blob. Ao passar o mouse sobre cada blob, Leginon informará seu tamanho conforme calculado por Ptolomeu. Anote as maiores e menores bolhas.
      2. Nas configurações Limite, altere o Intervalo de Filtro mínimo e máximo para incluir quadrados desejáveis e excluir quadrados indesejáveis.
      3. Clique no botão Localizar quadrados na barra de ferramentas superior. Ajuste o Intervalo de Filtros até Localizar Quadrados bem direcionados .
      4. Nas configurações de aquisição, escolha valores para o Número máximo de destinos e Número de grupo de destino a ser amostrado. Esses parâmetros definirão quantos quadrados e grupos de quadrados são direcionados.
      5. Quando estiver satisfeito com os parâmetros, clique no botão Reproduzir . Um exemplo de atlas após a configuração é mostrado na Figura 6 Suplementar.
    8. Configure os parâmetros do localizador de furos.
      1. No nó Hole_Targeting, use a ferramenta régua para medir o diâmetro de um furo.
      2. Nas configurações do modelo, insira o diâmetro no diâmetro do modelo final e clique em Testar. Ajuste o diâmetro até que todos os orifícios tenham picos brancos brilhantes no centro.
      3. Nas configurações de Limite, clique em Testar. Ajuste o valor A até que a imagem binarizada mostre áreas brancas somente onde os buracos estão localizados.
      4. Nas configurações de Blobs, opte por excluir destinos de borda usando a régua para determinar uma distância mínima da borda e inserir esse valor. Os blobs podem ser filtrados por seu tamanho, arredondamento e número desejado. Passe o mouse sobre os blobs para mostrar seus valores. Clique em Testar para inspecionar os valores atuais.
      5. Nas configurações de rede, insira o raio dos furos e o espaçamento entre os furos (use a ferramenta de medição) e, em seguida, clique no botão 42 para medir o valor de Intensidade de Referência de uma área de vácuo (furo vazio ou filme de suporte quebrado).
      6. Nas configurações de aquisição, marque Usar subconjunto dos destinos de aquisição e defina o valor Máximo de Amostra para um número pequeno, como 2. Defina uma ampla faixa de médias e desvios padrão da espessura do gelo (meça esses valores passando o mouse sobre os alvos). Clique em Testar segmentação para randomizar a seleção de destino com os valores acima.
      7. Clique no botão Reproduzir quando estiver satisfeito com todas as configurações. Leginon realizará Z_Focus de estágio e coletará o primeiro alvo. Uma imagem de exemplo após a configuração é mostrada na Figura 7 Suplementar.
    9. Configurar parâmetros de segmentação de exposição.
      1. Nas configurações de buraco, defina o Shell Script para o caminho de script hl_finding.sh na instalação de Ptolomeu. Defina a pontuação mínima a ser aceita como ≤0. Insira o raio dos orifícios (use a ferramenta de medição) e clique no botão 42 para medir o valor de Intensidade de Referência de uma área de vácuo (furo vazio ou filme de suporte quebrado). Clique em Testar para encontrar a rede de buracos.
      2. Nas configurações de aquisição, marque Usar subconjunto dos destinos de aquisição e defina o valor Máximo de amostra para um número pequeno, como 4, para coletar em um subconjunto de furos para triagem. Defina uma ampla faixa de médias e desvios padrão da espessura do gelo (meça esses valores passando o mouse sobre os alvos).
      3. Clique no botão Reproduzir quando estiver satisfeito com todas as configurações. O Leginon realizará o Foco eucêntrico e coletará imagens de alta ampliação, que podem ser vistas no nó Exposição . Uma imagem de exemplo após a configuração é mostrada na Figura Suplementar 8.
    10. Verifique a próxima imagem Exposure_Targeting para ver se as configurações acima ainda são suficientes. Quando estiver satisfeito, desmarque a opção Permitir para verificação do usuário de alvos selecionados nas configurações Segmentação por exposição e Segmentação por furo.
      Observação : triagem agora deve ser executado autônomo para a grade atual. Esta sessão será usada como a sessão de modelo para todas as grades.
  2. Quando a triagem da grade for concluída, clique em Arquivo > Sair para fechar o Leginon.
  3. Configurar o Smart Leginon Autoscreen
    1. Em uma janela de terminal, execute o autoscreen.py do Smart Leginon.
    2. Selecione gui, insira uma lista separada por vírgulas de slots de grade na tela, insira o nome completo do fluxo de trabalho, insira o nome da sessão do modelo para basear novas sessões (isso pode ser encontrado no visualizador de imagens do Appion) e insira o valor de altura z da sessão do modelo (Figura 9 Suplementar).
    3. Uma gui será aberta para permitir que se insira o nome da sessão para cada grade e selecione suas respectivas associações de projeto (Figura Suplementar 10).
      NOTA: O Smart Leginon Autoscreen agora usará as configurações de sessão do modelo para examinar automaticamente cada grade e alternar entre grades autônomas.
    4. Acompanhe durante a coleta em Leginon, Appion e no computador do microscópio, ou deixe o microscópio completamente desacompanhado.
      NOTA: Uma vez que todas as grades são rastreadas, Smart Leginon irá fechar as válvulas de coluna no microscópio.

Representative Results

Seguindo o protocolo, as sessões de triagem de crioEM podem ser executadas automaticamente e com sucesso para a maioria (80%-90%) das grades e condições de holey. Vários exemplos e experimentos foram apresentados anteriormente 8,9 para demonstrar os resultados esperados de sessões bem-sucedidas do Smart Leginon Autoscreen. Uma sessão de Autoscreen bem-sucedida começa com ~10 min de configuração e geralmente resulta em um completo de 12 grades filtradas automaticamente após cerca de 6 h (30 min por grade), onde 3-5 quadrados de diferentes tamanhos e 3-5 furos por quadrado são fotografados em alta ampliação, permitindo que o usuário determine rapidamente as características da amostra em cada grade e itere rapidamente através das condições da amostra/grade (Figura 3). Ocasionalmente, as sessões não são bem-sucedidas, geralmente devido ao direcionamento de tela automática para quadrados quebrados, não interpretando grandes gradientes de espessura de gelo em toda a grade ou entre quadrados corretamente, ou falha em identificar buracos adequadamente em grades de carbono. Além disso, possíveis vazamentos de memória podem fazer com que o Leginon trave devido ao uso excessivo de memória, o que pode ser resolvido liberando RAM, ou reinicializando o computador, ou melhorado adicionando mais RAM ao computador.

figure-representative results-1505
Figura 1: Fluxo de trabalho do Smart Leginon Autoscreen. Uma visão geral de alto nível do fluxo de trabalho Smart Leginon Autoscreen. Primeiro, uma sessão de modelo é criada selecionando parâmetros para uma grade representativa no lote de grades a serem examinadas. Configurar o Leginon e criar uma sessão de modelo leva menos de 45 minutos. Em segundo lugar, o Autoscreen é configurado para usar os parâmetros de sessão do modelo para filtrar todas as grades no. A configuração do Autoscreen leva menos de 10 minutos. Finalmente, o Autoscreen encerra a sessão de triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-representative results-2444
Figura 2: Tubulação crioEM convencional de partícula única antes da triagem automatizada. As etapas mais comuns no pipeline crioEM convencional de partícula única antes da triagem automatizada, juntamente com componentes que podem ser melhorados. Cada etapa é colorida para aproximar o quanto de um gargalo a etapa é em relação a outras. A seta circular azul representa vários loops de feedback entre a maioria das etapas. O rendimento em várias etapas depende muito da amostra, do financiamento e da localização do pesquisador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-representative results-3339
Figura 3: Resultados representativos do Smart Leginon Autoscreen. Imagens representativas em várias escalas seguindo o protocolo Smart Leginon Autoscreen coletadas em um TFS Krios cryoTEM com um filtro de energia BioQuantum e câmera K3. (A) Uma imagem composta do «atlas» que mostra uma visão geral de uma grelha crioEM. (B-F) Imagens em várias escalas de locais indicados no atlas de grade. Imagens de baixa magnificação na primeira linha, imagens de aumento médio na segunda fileira e imagens de alta magnificação na terceira fileira foram selecionadas automaticamente para obter informações sobre a amostra de quadrados de gelo finos a grossos. A espessura do gelo estimada por Leginon é mostrada na parte inferior. As barras de escala são 500 μm em (A) e 10 μm para a primeira fileira, 5 μm para a segunda fileira e 100 nm para a terceira fileira para (B-F). Esse valor foi modificado com a permissão de Cheng et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

gr: Gradequadra: Quadradohln: Furoventilador: Auto- focofcn: Foco centralenn: Exposição 
Ampliação21026006700120000120000120000
Defocus-0.0002-0.00015-0.00015-2 x 10-06 -7 x 10-07 -2,5 x 10-06 
Tamanho do spot554222
Intensidade1.10.830.650.440.440.45
Dimensão De 1024 a 1024De 1024 a 1024De 1024 a 1024De 1024 a 1024De 1024 a 10244096 x 4096
Offset0, 00, 00, 00, 0512, 5120, 0
Binning4 x 44 x 44 x 44 x 42 x 21 x 1
Tempo de exposição (ms)2005005005005001000
Pré-Exposição(ões)000000
Dose (e/Å2)------36.536.564.7
Salvar quadros brutosNãoNãoNãoNãoNãoSim

Tabela 1: Parâmetros predefinidos para triagem de grade crioEM no Simons Electron Microscopy Center (SEMC) usando um crioTEM Glacios com uma câmera Falcon 3EC. Os parâmetros para cada predefinição comumente usada em um crioTEM Glacios com uma câmera Falcon 3EC no SEMC são mostrados. Diferentes microscópios terão ampliações variadas disponíveis e diferentes experimentos usarão parâmetros variados, como desfoco e tempo de exposição.

gr: Gradequadra: Quadradohln: Furoventilador: Auto- focofcn: Foco centralenn: Exposição 
Ampliação6417002850750007500075000
Defocus0-5 x 10-05 -5 x 10-05 -1 x 10-06 -7 x 10-07 -2 x 10-06 
Tamanho do spot699667
Intensidade0.0011,65 x 10-05 1,5 x 10-05 4,3 x 10-07 4,3 x 10-07 5,5 x 10-07 
Largura do filtro de energia------202020
DimensãoDe 1024 a 1024De 1024 a 1024De 1024 a 1024De 1024 a 1024De 2048 a 20484096 x 4096
Offset0, 00, 00, 00, 00, 00, 0
Binning 4 x 44 x 44 x 44 x 42 x 21 x 1
Tempo de exposição (ms)500200010005003008700
Pré-Exposição(ões)000000
Dose (e/Å2)----------47.4
Salvar quadros brutosNãoNãoNãoNãoNãoSim

Tabela 2: Parâmetros predefinidos para triagem de grade cryoEM no SEMC usando um cryoTEM Krios com uma câmera Selectris X e Falcon 4i. Os parâmetros para cada predefinição comumente usada em um Krios com um filtro de energia Selectris X e câmera Falcon 4i na SEMC são mostrados. Diferentes microscópios terão ampliações variadas disponíveis e diferentes experimentos usarão parâmetros variados, como desfoco e tempo de exposição.

gr: Gradequadra: Quadradohln: Furoventilador: Auto- focofcn: Foco centralenn: Exposição 
Ampliação15509402250810008100081000
Defocus0-5 x 10-05 -5 x 10-05 -1 x 10-06 -7 x 10-07 -2 x 10-06 
Tamanho do spot487666
Intensidade0.00150.000177,3 x 10-05 1,3 x 10-06 1,3 x 10-06 9,2 x 10-07 
Largura do filtro de energia----50202020
DimensãoDe 1024 a 1024De 1440 a 1024De 1440 a 1024De 1440 a 1024De 1008 a 10085760 x 4092
Offset 0, 00, 00, 00, 0936, 5190, 0
Binning4 x 48 x 88 x 88 x 84 x 42 x 2
Tempo de exposição (ms)2506006005005002100
Pré-Exposição(ões)000000
Dose (e/Å2)----------51
Salvar quadros brutosNãoNãoNãoNãoNãoSim

Tabela 3: Parâmetros predefinidos para triagem de grade de crioEM no SEMC usando um cryoTEM Krios com uma câmera BioQuantum e K3. Os parâmetros para cada predefinição comumente usada em um Krios com um filtro de energia BioQuantum e uma câmera K3 no SEMC são mostrados. Diferentes microscópios terão ampliações variadas disponíveis e diferentes experimentos usarão parâmetros variados, como desfoco e tempo de exposição.

Figura suplementar 1: Configurações de segmentação quadrada e configurações quadradas para Smart Leginon. (A) Configurações de segmentação quadrada. (B) Configurações quadradas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Configurações de Hole Targeting e Hole para Smart Leginon. (A) Configurações de segmentação de furos. (B) Configurações de furos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Configurações de direcionamento de exposição e configurações de exposição para Smart Leginon. (A) Configurações de segmentação por exposição. (B) Configurações de exposição. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 suplementar: Configurações de foco e configurações de sequência de foco para Smart Leginon. (A) Configurações de foco. (B) Configurações da Sequência de Foco (Desfocar1). (C) Configurações de Sequência de Foco (Desfocar2). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 5 suplementar: Configurações de Z_Focus e configurações de sequência de Z_Focus para Smart Leginon. (A) Z_Focus configurações. (B) Z_Focus configurações de sequência (Stage_Tilt_Rough). (C) Z_Focus Configurações de sequência (Stage_Tilt_Fine). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: Um atlas de exemplo após a configuração dos parâmetros Smart Leginon Square_Targeting. Círculos azuis são bolhas, sinais de mais verdes são locais de aquisição e o 'x' marrom é o local do estágio atual. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 7: Um atlas de exemplo após a configuração do Smart Leginon Hole_Targeting parâmetros. Sinais de mais roxos são locais de treliça, sinais de mais verdes com caixas são locais de aquisição e o sinal de mais azul é o local de foco. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 8: Um exemplo de atlas após a configuração do Smart Leginon Exposure_Targeting parâmetros. Círculos azuis são bolhas, sinais de mais verdes são locais de aquisição e o sinal de mais azul é o local de foco. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 9: Configuração do terminal Smart Leginon Autoscreen. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 10: Configuração da gui Smart Leginon Autoscreen. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Neste protocolo, descrevemos o pipeline para Smart Leginon Autoscreen e, adicionalmente, o uso básico do Leginon para aqueles novos no software de coleta. O crioEM de partícula única está prestes a se tornar a técnica de resolução de estrutura de proteína tridimensional (3D) mais produtiva até o final de 202417. O pipeline cryoEM de partícula única consiste em várias etapas que estão constantemente sendo otimizadas para aumentar a qualidade e a taxa de transferência dos dados. A Figura 2 mostra as etapas mais comuns (preparação da amostra, preparação da grade, tempo e esforço de triagem, tempo de coleta de alta resolução, processamento ao vivo e pós-processamento completo), juntamente com outros componentes da tubulação que podem ser melhorados (acesso ao microscópio de triagem, velocidade e precisão do estágio, velocidade da câmera e acesso ao microscópio de alta resolução). Os resultados da maioria das etapas tornam-se loops de feedback para as etapas anteriores (setas azuis na Figura 2), tornando todo o pipeline altamente interdependente. Cada etapa na Figura 2 é colorida para aproximar o quanto de um gargalo a etapa é em relação a outras. O Smart Leginon Autoscreen reduz significativamente o tempo e o esforço do operador para a triagem de 12 grades de 6 h para menos de 10 min, aliviando esse gargalo e permitindo um feedback mais rápido para a preparação da amostra/grade (Figura 3).

Há várias etapas críticas no Protocolo, descritas na Figura 1. É fundamental que a grade usada para criar a sessão de modelo seja representativa das grades restantes a serem examinadas. É importante ressaltar que o Leginon se lembra de todas as configurações em todo o processo de configuração para criar uma sessão de modelo (etapas azuis na Figura 1), o que permite que sessões de modelo recorrentes sejam configuradas mais rapidamente a cada vez. Ao criar uma sessão de modelo, a etapa mais crítica é configurar a segmentação em todas as ampliações para que os parâmetros e limites reflitam a variação esperada nas grades a serem examinadas. Os vários botões 'Test' permitem eficiência neste processo de configuração. Durante uma sessão de tela automática, é fundamental monitorar as primeiras grades no Appion para detectar rapidamente quaisquer problemas e corrigi-los dentro do Leginon o mais rápido possível.

O fluxo de trabalho típico no SEMC é alimentar dados de tela automática no CryoSPARC Live18 e usar essas informações adicionais para informar os loops de feedback na preparação de amostra/grade. Durante os dias intensivos de otimização crioEM do pesquisador-operador, as informações sobre as condições da amostra e da grade são realimentadas na preparação da amostra e da grade, enquanto o Autoscreen ainda está rastreando as grades. Isso permite que várias dezenas de grades sejam congeladas e rastreadas por semana8.

O Smart Leginon Autoscreen funciona para a maioria (80%-90%) das redes e condições observadas no SEMC. Os restantes 10%-20% das grelhas incluem aquelas que por vezes não funcionam bem - grelhas com mínima diferença de contraste entre furos e substrato; grades com furos e espaçamento menores (por exemplo, 0,6/0,8) - e grades onde o direcionamento através de várias grades é muitas vezes impraticável - Spotiton/Chameleon19,20 grades que consistem em faixas de amostra em toda a grade; grades rendilhadas. Observe que a coleção de grade inclinada com Autoscreen está em desenvolvimento, mas ainda não está disponível. Pode ser possível modificar o protocolo para trabalhar com grades Spotiton/Chameleon primeiro imageando áreas da faixa manualmente para determinar limiares de parâmetros estreitos, depois tentando agrupar quadrados maiores e menores, respectivamente, na etapa 2.1.7.4 e, em seguida, selecionando alvos do grupo com gelo. O objetivo desta modificação é fazer com que o Smart Leginon separe os quadrados vazios e não vazios em dois grupos. Se os parâmetros forem encontrados, eles podem não se estender bem para as grades restantes a serem examinadas. Também pode ser possível modificar o protocolo para trabalhar com grades lacey removendo o script hl_finding.sh na etapa 2.1.9.1 e configurando os parâmetros para direcionar áreas mais claras/escuras conforme desejado. A taxa de sucesso desta modificação pode variar de grade para grade com base nas espessuras do gelo e no material da grade.

A solução de problemas durante uma sessão de tela automática é possível e, às vezes, apropriada. Alterações nos parâmetros predefinidos (por exemplo, desfocagem) e de segmentação (por exemplo, limites de segmentação de furos) podem ser feitas durante a coleta automatizada. Enquanto uma sessão de tela automática estiver sendo coletada, uma sessão de grade não poderá ser cancelada porque encerrará autoscreen.py. No entanto, os botões Anular nos nós de Direcionamento podem ser usados para ignorar qualquer parte de uma grade ou uma grade inteira. Ocasionalmente, autoscreen.py pode usar muita memória e congelar, oferecendo duas opções: 'forçar a saída' ou 'esperar'. Se 'forçar encerramento' for selecionado, todo o script será encerrado, exigindo que o usuário execute novamente o script a ser aplicado às grades restantes para triagem. Se 'esperar' for selecionado, o script continuará e as configurações poderão ser alteradas para evitar congelamento futuro, por exemplo, desativar a exibição da imagem no nó Exposição, diminuir o tamanho do pixel no atlas ou executar um script de limpeza de memória. Se o programa congelar sem oferecer as duas opções, os erros de memória podem não resolver por conta própria, causando uma pausa na aquisição. A opção 'forçar encerramento' pode ser útil neste caso.

Smart Leginon Autoscreen é usado regularmente na SEMC. À medida que os gargalos no pipeline de crioEM de partícula única continuam a ser reduzidos, a adoção do cryoEM continuará a aumentar para ajudar a responder a questões biológicas. Este protocolo é um passo na direção de otimizar todo o pipeline, fornecendo um caminho claro para reduzir significativamente os loops de feedback.

Acknowledgements

Parte deste trabalho foi realizado no Simons Electron Microscopy Center no New York Structural Biology Center, com apoio da Simons Foundation (SF349247), NIH (U24 GM129539) e NY State Assembly.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Glacios cryoTEM Thermo Fisher Scientific GLACIOSTEMFEG, 200 keV, Falcon 3EC camera 
Krios cryoTEM Thermo Fisher Scientific KRIOSG4TEMXFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera 
Leginon Simons Electron Microscopy Center http://leginon.org 
Ptolemy Simons Machine Learning Center https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy 

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