Автоматизация скрининга криоэлектронной микроскопии в нескольких сетях с помощью Smart Leginon

Summary

Многосетчатый скрининг криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) часто является утомительным процессом, требующим многочасового внимания. В этом протоколе показано, как настроить стандартную коллекцию Leginon и Smart Leginon Autoscreen для автоматизации этого процесса. Этот протокол может быть применен к большинству решеток из фольги с отверстиями в криоЭМ.

Abstract

Достижения в области криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) за последнее десятилетие позволили структурным биологам регулярно разрешать высокомолекулярные белковые комплексы с почти атомным разрешением. Общий рабочий процесс всего конвейера cryoEM включает в себя итерацию между подготовкой образца, подготовкой криоЭМ-сетки и скринингом образца/сетки, прежде чем перейти к сбору данных с высоким разрешением. Итерация между подготовкой образца/сетки и скринингом, как правило, является основным узким местом для исследователей, поскольку каждый итеративный эксперимент должен быть оптимизирован с учетом концентрации образца, буферных условий, материала сетки, размера отверстия сетки, толщины льда и поведения белковых частиц во льду, а также других переменных. Кроме того, после того, как эти переменные удовлетворительно определены, сетки, подготовленные в одинаковых условиях, сильно различаются по тому, готовы ли они к сбору данных, поэтому рекомендуется провести дополнительные сеансы скрининга перед выбором оптимальных сеток для сбора данных с высоким разрешением. Этот процесс подготовки и скрининга образцов/сеток часто занимает несколько десятков сеток и дней рабочего времени оператора за микроскопом. Кроме того, процесс скрининга ограничен доступностью оператора/микроскопа и доступностью микроскопа. В этой статье мы продемонстрируем, как использовать Leginon и Smart Leginon Autoscreen для автоматизации большинства скринингов с криоEM-решеткой. Autoscreen сочетает в себе машинное обучение, алгоритмы компьютерного зрения и алгоритмы работы с микроскопом, чтобы устранить необходимость в постоянном ручном вводе данных оператором. Autoscreen может автономно загружать и отображать сетки с многомасштабной визуализацией с помощью автоматизированной кассетной системы обмена образцами, что приводит к автоматическому скринингу сетки для всей кассеты. В результате, время, затрачиваемое оператором на просеивание 12 сеток, может быть сокращено до ~10 мин при использовании Autoscreen по сравнению с ~6 ч при использовании предыдущих методов, которые затрудняются из-за неспособности учесть высокую вариабельность между сетками. Этот протокол сначала знакомит с базовой настройкой и функциональностью Leginon, а затем демонстрирует функциональность Autoscreen шаг за шагом от создания шаблонного сеанса до завершения сеанса автоматического скрининга с 12 сетками.

Introduction

Криоэлектронная микроскопия одиночных частиц (криоЭМ) позволяет определять структуру очищенных высокомолекулярных комплексов с близким к атомному разрешению. КриоЭМ-эксперимент с одной частицей требует только одной или двух хорошо подобранных сеток, выбранных из гораздо большего набора сеток с различными условиями образца и сетки. Скрининг под микроскопом для изучения этих сеток включает в себя визуализацию каждой сетки с несколькими увеличениями, чтобы определить, какая сетка удовлетворяет большинству ключевых требований для сбора данных с высоким разрешением, включая толщину льда, достаточные площади для полного сбора данных, чистоту белка, концентрацию белка, стабильность белка и минимальные проблемы предпочтительной ориентации¹. Оптимизация этих ключевых требований часто включает в себя обратную связь между просеиванием под микроскопом и условиями приготовления, такими как производство белка, выбор буфера, потенциальные детергенты и тип сетки ^2,3,4 (рис. 1). Обычное сетчатое просеивание выполняется вручную или полувручную с помощью такого программного обеспечения, как Leginon⁵, SerialEM⁶ и EPU⁷. Обычный скрининг требует, чтобы оператор микроскопа часами сидел за микроскопом для скрининга нескольких сеток, что создает значительное узкое место в рабочем процессе с одним частицей с высоким разрешением, занимая оператора механическими операциями, а не оптимизацией образца/сетки.

Ранее были представлены Smart Leginon Autoscreen и лежащее в его основе программное обеспечение для машинного обучения Ptolemy, и были описаны лежащие в их основе методы и алгоритмы вместе с примерами ^8,9. Несколько других программных пакетов либо способны, либо работают в направлении полностью автоматизированного многосетчатого скрининга¹⁰, включая SmartScope¹¹, Smart EPU¹² и CryoRL^13,14. Чтобы устранить узкое место скрининга, Smart Leginon позволяет пользователю сначала настроить параметры скрининга в сеансе микроскопа шаблона, а затем использовать параметры этого сеанса в качестве шаблона для скрининга полной кассеты сеток в автозагрузчике микроскопа. Исключается вся ручная работа во время кассетного грохочения, что позволяет значительно эффективнее работать в контуре обратной связи оптимизации.

В этом протоколе описан полный рабочий процесс Smart Leginon Autoscreen, чтобы считыватель мог самостоятельно выполнять полностью автоматизированный многосетчатый криоЭМ-скрининг. Для тех, кто не знаком с Leginon, первый раздел протокола описывает традиционное использование Legunon. Эти знания складываются из многолетнего опыта работы с несколькими микроскопами с автозагрузкой, которые затем используются в последующем разделе протокола Smart Leginon. Дополнительные обучающие видео можно найти на https://memc.nysbc.org.

Protocol

Чтобы следовать этому протоколу, изображенному на рисунке 2, Leginon 3.6+ должен быть установлен на компьютере микроскопа и на дополнительной рабочей станции Linux, а Ptolemy должен быть установлен на рабочую станцию Linux. Этот протокол разрабатывался в течение нескольких лет с использованием микроскопов Glacios и Krios компании Thermo Fisher Scientific (TFS). Этот протокол предполагает, что считыватель уже настроил Leginon, Appion¹⁵, связанную с ними базу данных, калибровки микроскопа, выполнил прямое выравнивание на микроскопе и настроил два приложения Leginon: одно для стандартного сбора одиночных частиц и одно для сбора одиночных частиц с помощью Птолемея. Информация о настройке Leginon доступна здесь: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual. Информация о настройке Птолемея в Leginon доступна здесь: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening. Загрузите Легинона с http://leginon.org и Птолемея с https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy. Leginon распространяется под лицензией Apache версии 2.0, а Ptolemy — под лицензией CC BY-NC 4.0.

1. Применение Легинона

1. Старт Leginon
   1. На компьютере с микроскопом под управлением Windows закройте все клиенты Legunon, а затем снова откройте его. На рабочей станции Linux откройте окно терминала и введите start-leginon.py или соответствующий системный псевдоним для запуска Leginon.
   2. В новом окне Leginon Setup выберите Create a new session (Создать новый сеанс) и нажмите кнопку Next (Далее).
   3. Выберите проект из выпадающего списка и нажмите кнопку Далее.
   4. Оставьте имя без изменений, выберите правильный держатель для настройки микроскопа и нажмите кнопку Далее.
   5. В качестве описания введите соответствующую информацию, такую как название микроскопа, описание сетки/образца и описание эксперимента, а затем нажмите кнопку Далее.
   6. Для каталога образов убедитесь, что выбрана соответствующая файловая система и что полный путь подходит для сохранения изображений, а затем нажмите кнопку Далее.
   7. В разделе Подключение к клиентам нажмите кнопку Изменить. В раскрывающемся меню выберите все компьютеры, которые должны быть подключены, и нажмите кнопку + для каждого из них, а затем нажмите кнопку «ОК » и «Далее».
   8. Введите правильный размер диафрагмы C2 и нажмите кнопку Далее. Это значение можно найти на вкладке «Диафрагмы » программного обеспечения TFS TUI.
2. Интерфейс Leginon
   1. Выберите «Приложение» на панели инструментов и нажмите «Выполнить».
   2. Выберите нужное приложение из выпадающего меню (при необходимости нажмите «Показать все »). Установите main на компьютер Leginon, а прицел и камеру на соответствующий компьютер, затем нажмите кнопку Run. Левая часть главного окна Leginon будет заполнена узлами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На левой панели отображаются все узлы Legunon. Зеленые узлы значка камеры — это изображения, которые будут сохранены: «Сетка», «Квадрат», «Отверстие » и «Экспозиция». Узлы со знаком цели — это изображения с меньшим увеличением для нацеливания на изображения с большим увеличением. Фиолетовые узлы камеры — это узлы, которые запрограммированы на поиск эвцентрической z-высоты и эвцентрического фокуса. Кроме того, имеются узлы для выравнивания пика нулевых потерь, мониторинга буферного цикла, мониторинга заполнения жидким азотом, сбора изображений с коррекцией усиления, расчета толщины льда (IceT) и навигации по сетке при различных увеличениях с использованием сцены и сдвига изображения.
   3. Менеджер пресетов
      1. Нажмите на узел Presets_Manager. В этом узле щелкните нижний значок для импорта пресетов или значок над ним, чтобы создать новый шаблон настроек на основе текущего состояния микроскопа.
      2. Если щелкнуть по нижнему значку, откроется окно Импорт стилей . Выберите нужный ТЭМ и цифровую камеру, затем нажмите «Найти» и выберите последний сеанс с нужными предустановками. Выделите все нужные стили и нажмите «Импорт», затем нажмите «Готово».
         ПРИМЕЧАНИЕ: В узле Presets Manager теперь должны быть перечислены все импортированные и созданные пресеты. Рекомендуется иметь пресеты для нескольких увеличений и фокусировки, в том числе gr: Увеличение по сетке, sq: Квадратное увеличение, hln: Увеличение отверстия, вентилятор: Автофокус, fcn: Центральный фокус, enn: Увеличение экспозиции (конец 'n' относится к нанозонду). Типичные предустановленные параметры для каждого увеличения приведены в Таблице 1, Таблице 2 и Таблице 3. Обратите внимание, что в этом протоколе используется размер апертуры C2 70 мкм для Glacios, 50 мкм для Krios с Selectris X и Falcon 4i и 100 мкм для Krios с BioQuantum с K3.
   4. Навигация и эвцентрическая высота
      1. Чтобы ознакомиться с управлением микроскопом через Leginon и установить z-высоту сетки, перейдите в узел Навигация, выберите предустановку gr вверху и нажмите на красную стрелку справа, чтобы отправить предустановленные настройки на микроскоп. Микроскоп должен обновиться через 1-2 с. После обновления нажмите кнопку камеры справа, чтобы получить изображение.
      2. С помощью инструмента «Курсор» выделите квадрат сетки, в котором будет перемещаться рабочая область. Нажмите на увеличение sq , а затем на красную стрелку для отправки в микроскоп, и нажмите кнопку камеры , чтобы получить изображение.
      3. Перейдите к узлу Z_Focus и нажмите кнопку Simulate Target в верхней части рядом с серединой кнопок. Во время сбора изображений для фокусировки с наклоном объекта переключитесь в режим корреляции и следите за пиком, чтобы убедиться, что он находится в углу изображения корреляции. После завершения фокусировки убедитесь, что рабочая область установлена на z-высоту сетки.
   5. Коррекция комы
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом подразделе предполагается, что прямое выравнивание уже было выполнено, а коррекция запятой не была выполнена.
      1. Перейдите к области сетки, которая создает четкие кольца Тона, например к углеродной подложке.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Перекрестная решетка может быть использована, если сбор должен производиться на золотой сетке.
      2. В настройках Beam_Tilt_Image убедитесь, что Порядок пресетов включает только fcn с четырьмя направлениями наклона под углом 0,005 радиан.
      3. Нажмите кнопку Имитировать цель, чтобы создать таблицу Zemlin. Нажмите «Табло» в левой части главного окна, чтобы просмотреть его.
      4. Исправьте запятую, сравнив левое и правое преобразования Фурье друг с другом, а также верхнее и нижнее преобразования Фурье друг с другом. Если пары изображений не идентичны, сначала щелкните значок курсора справа от корректировки изображения, затем щелкните немного от центра на изображении Tableau в направлении разницы и подождите, пока не будет собран новый набор преобразований Фурье. Повторяйте до тех пор, пока преобразования Фурье не станут идентичными.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый клик по Табло занимает несколько секунд, и в течение этого времени не следует делать никаких дополнительных кликов.
   6. Получение ссылок
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот раздел, если камера имеет автоматические ссылки на оборудование.
      1. В узле Navigation (Навигация) отправьте предустановку малого увеличения, например gr, и перейдите в область, где нет препятствий для траектории луча.
      2. Убедитесь, что положение предметного столика не загораживается траекторией луча, сделав снимок со средним увеличением с помощью предустановки sq или hln .
      3. Отправьте предустановку enn с большим увеличением на микроскоп.
      4. В настройках узла Correction (Коррекция) выберите нужную информацию об инструменте и настройте конфигурацию камеры в соответствии с настройками коллекции.
      5. Соберите темное эталонное изображение, закрыв клапаны колонки на микроскопе, затем в узле Correction (Коррекция) выберите Dark (Темный ) и Both Channels (Оба канала ) в выпадающем меню вверху и нажмите кнопку Acquisition camera ( Получить камеру) справа.
      6. После завершения выберите «Яркий » в раскрывающемся меню и нажмите «Получить». Leginon автоматически откроет клапаны колонки.
      7. Убедитесь, что усиление было собрано правильно, выбрав «Скорректировано » в раскрывающемся меню, нажав «Получить» и просмотрев полученное изображение.
   7. Эталонное изображение толщины льда
      1. Если микроскоп имеет энергетический фильтр, то в настройках узла IceT поставьте галочку напротив Collect ice thickness image, введите 395 в поле Mean free path и заполните остальные значения для setup.
      2. Если микроскоп не имеет энергетического фильтра, то в узле Navigation отправьте пресет enn на микроскоп и нажмите Acquire. Обратите внимание на Среднее значение пикселя в левой части. В настройках узла IceT отметьте галочкой Calculate ice thickness from aperture limited scattering, введите 1055 для коэффициента ALS и измеренного среднего значения пикселя.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Значения 395 и 1055 были определены для TFS Krios и Glacios соответственно, как описано ранее¹⁶, и, возможно, потребуется повторная калибровка для различных конфигураций микроскопов.
   8. Калибровка дозы изображения
      1. В Preset_Manager выберите предустановку enn и нажмите кнопку камеры (Получить изображение дозы для выбранной предустановки). Проверьте измеренную дозу на дне. Если оно близко к ожидаемому значению (обычно от 30 до 70), нажмите кнопку ДА.
   9. Предустановленные выравнивания
      1. В Preset_Manager проверьте все предустановки большого увеличения (enn, fcn и вентилятор), чтобы убедиться, что сдвиг изображения и сдвиг луча равны 0, 0.
      2. На компьютере микроскопа перейдите к углеродной области.
      3. На компьютере Leginon в узле Navigation (Навигация) получите изображение с предустановкой gr .
      4. Найдите интересующий вас объект и перейдите к нему с помощью инструмента курсора.
      5. Получите изображение с предустановкой hln и переместите уникальную часть интересующего вас объекта в центр с помощью инструмента курсора.
      6. Получите изображение с предустановкой enn и переместите его в ту же уникальную часть интересующего вас объекта с помощью инструмента курсора.
      7. Выберите сдвиг изображения в выпадающем меню и получите изображение с предустановкой hln. Переместите в ту же уникальную часть интересующего вас объекта с помощью инструмента курсора.
      8. В Presets_Manager выберите пресет hln , нажмитекнопку s ettings и импортируйте сдвиг изображения из Навигации , щелкнув левую зеленую стрелку рядом со значениями Image shift .
      9. Повторите шаги 2.9.7 и 2.9.8 для предустановок sq и gr .
   10. Сетчатый атлас
       1. На компьютере микроскопа закройте клапаны колонки и уберите апертуру объектива. Перейдите к узлу Grid_Targeting. В настройках измените метку сетки. Выберите желаемый радиус атласа (максимальный радиус 0,0009 м). Нажмите кнопку ОК. Затем нажмите кнопку «Рассчитать калькулятор атласа » вверху и нажмите зеленую кнопку «Воспроизвести» («Отправить цели»).
       2. В узле Square_Targeting изображения сетки будут собраны и сшиты вместе, чтобы сформировать атлас. Увеличивайте и уменьшайте масштаб с помощью выпадающего меню и регулируйте контрастность и яркость. Используйте полосы прокрутки для перемещения по сетке.
       3. После того, как атлас будет собран, при необходимости вставьте отверстие объектива.
       4. Если микроскоп оснащен энергетическим фильтром, выберите эталонную мишень в центре ломаного квадрата, нажмите кнопку Play и перейдите к выравниванию ZLP в следующем подразделе. В противном случае пропустите шаг выравнивания ZLP.
   11. Выравнивание ZLP
       1. В настройках узла Align_ZLP выберите позицию этапаn, чтобы переместить эталонную цель, и выберите менеджер пресетов в качестве движущей силы. Снимите флажок байпасного кондиционера, затем нажмите OK.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь юстировка ZLP должна быть настроена таким образом, чтобы микроскоп периодически перемещался к эталонной мишени и выполнял процедуру выравнивания ZLP камеры. Время перенастройки ZLP 30 минут и 60 минут, как правило, безопасно для энергетических фильтров Gatan BioQuantum и TFS Selectris X соответственно. Эти значения варьируются в зависимости от условий работы фильтра, включая постоянную влажность, постоянную температуру, изоляцию электромагнитного поля и виброизоляцию.
   12. Настройка таргетинга шаблона отверстия
       1. В узле Square_Targeting выберите несколько целей сбора данных и нажмите кнопку Воспроизвести.
       2. В настройках узла Hole_Targeting убедитесь, что установлены флажки Разрешить пользовательскую проверку выбранных целей и Поставить цели в очередь. Кроме того, установите флажок Пропустить автоматический поиск отверстий на данный момент. Нажмите «Применить», затем «ОК».
       3. В главном окне используйте сочетание клавиш Ctrl-Shift-правую кнопку мыши , чтобы удалить все цели. Выберите курсор захвата и разместите цели. Выберите курсор фокусировки и поместите цель фокусировки между целями захвата. Нажмите кнопку Воспроизвести.
       4. Для следующего Hole_Targeting изображения снимите флажок Пропустить автоматический поиск отверстий в настройках, затем нажмите Применить и ОК. Удалите автоматические цели, щелкнув правой кнопкой мыши Ctrl-Shift.
       5. Выберите инструмент «Линейка» и измерьте диаметр поперек отверстия. В разделе "Параметры шаблона" измените параметр "Окончательный диаметр шаблона" на измеренный диаметр отверстия. Не изменяйте исходный диаметр шаблона. Нажмите кнопку Тест. Если яркие пики не находятся в центре каждого отверстия, увеличьте Окончательный Диаметр Шаблона. Когда закончите, нажмите кнопку ОК.
       6. В настройках порога выберите значение для A , которое сегментирует отверстия по отдельности при нажатии кнопки "Тест" . Нажмите кнопку ОК , когда все будет удовлетворено.
       7. В параметрах Большие двоичные объекты введите значения и нажмите кнопку Тест. Максимальное число больших двоичных объектов равно 1, поэтому отображается только один большой двоичный объект. Нажмите кнопку ОК.
       8. В разделе "Параметры решетки" используйте инструмент "Линейка" для измерения расстояния между двумя отверстиями (от центра до центра). Введите значение в поле Интервал и нажмите кнопку Тест. Один сгусток превратится в точку решетки. Нажмите кнопку ОК.
       9. Перейдите в настройки сбора данных и оптимизируйте целевые показатели съемки, используя пороговые значения толщины льда и кнопку Тестовый таргетинг. Получите информацию о толщине льда, наведя курсор на точки решетки.
       10. Если цели захвата неудовлетворительны, используйте инструмент линейки , чтобы измерить расстояние и угол от точки решетки до желаемого местоположения объекта съемки. Удалите предыдущие точки шаблона целевого объекта приобретения . Нажмите на Auto Fill, поставьте 4 для количества целей и измените радиус и угол на измеренные значения. Нажмите кнопку ОК. Установите флажок Применить пороговое значение толщины льда к целям сбора данных с помощью шаблона.
       11. После того, как вы удовлетворитесь точками решетки и пороговыми значениями толщины льда, нажмите кнопку Submit Targets .
       12. При необходимости повторите любой из вышеописанных шагов для каждого выделенного квадрата. Отправьте всю очередь с помощью кнопки Submit Queued Targets (Отправить целевые объекты в очереди ) после того, как все квадратные цели будут отправлены.
       13. Легинон начнет фокусироваться и визуализировать каждый набор целей. В узле Z_Focus убедитесь, что эвцентрическая высота найдена правильно.
   13. Настройка таргетинга по шаблону экспозиции
       1. В узле Exposure targeting (Нацеливание экспозиции) появятся изображения увеличения отверстий. Используйте сочетание клавиш Ctrl-Shift и правой кнопкой мыши, чтобы удалить автоматические цели.
       2. Измерьте диаметр отверстия с помощью линейки. В настройках шаблона введите диаметр в поле Окончательный диаметр шаблона и нажмите кнопку Испытать. Теперь в центре каждой лунки должен быть пик. При необходимости отрегулируйте значения диаметра .
       3. В настройках порога отрегулируйте значение A до тех пор, пока на бинаризованном тестовом изображении не появятся белые области только там, где расположены отверстия.
       4. В параметрах "Большие двоичные объекты" нажмите кнопку "Тест". Должен появиться один большой двоичный объект на сегментированное отверстие. При необходимости увеличьте границу , чтобы удалить кляксы с краев изображения.
       5. В настройках решетки нажмите кнопку Тест. Настраивайте параметры до тех пор, пока все большие двоичные объекты не превратятся в точки решетки. Нажмите кнопку ОК.
       6. Нажмите на инструмент «Линейка» и измерьте расстояние между двумя точками решетки. В настройках Решетки измените Интервал на это расстояние.
       7. Наведите курсор на каждую точку решетки, чтобы увидеть среднюю интенсивность, среднюю толщину, интенсивность стандартного отклонения и толщину стандартного отклонения. Запишите интенсивности для каждой точки решетки и используйте их для установки желаемых параметров толщины льда в настройках съемки.
       8. Измерьте линейкой расстояние и угол от одной точки решетки до центра 4 отверстий. В настройках сбора данных удалите текущие целевые объекты фокусировки. Нажмите кнопку Автозаполнение и измените радиус и угол в соответствии с измеренными значениями. Щелкните Тестовый таргетинг, нажмите кнопку ОК и нажмите кнопку Отправить целевые объекты.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Leginon найдет эвцентрический фокус (узел Focus) и соберет экспозиции, которые появятся в узле Exposure.
       9. После того, как все мишени будут изображены, перейдите к узлу Exposure_Targeting , чтобы увидеть следующее изображение отверстия. В настройках снимите флажок Разрешить проверку пользователем выбранных целей. Кроме того, снимите флажки Ставить цели в очередь и Пропускать автоматический поиск отверстий. Нажмите кнопку «ОК » и нажмите кнопку «Отправить целевые объекты».
          ПРИМЕЧАНИЕ: Leginon будет автоматически собирать изображения на основе настроек, настроенных выше. Смотрите изображения и метаданные в Appion.
   14. Изменения могут быть внесены во время автоматизированного сбора. Например, можно в любое время изменить диапазон расфокусировки коллекции, отредактировав предустановку enn в Preset_Manager.
   15. Если сбор необходимо остановить, завершите очередь, нажав кнопки «Прервать » и «Прервать очередь » в узлах «Отверстие» и «Экспозиция».
   16. После завершения сбора перейдите в Приложение и нажмите Kill, затем перейдите в File и нажмите Exit.

2. Использование Smart Leginon Autoscreen

1. Создание сеанса Smart Leginon Template
   1. Следуйте инструкциям в разделе 1, чтобы запустить Leginon.
   2. Перейдите в раздел «Приложение » и нажмите «Выполнить». В окне «Запустить приложение » выберите приложение «Птолемей » (при необходимости выберите «Показать все »). Установите main на компьютер Leginon, а прицел и камеру на соответствующий компьютер.
   3. В Preset_Manager импортируйте пресеты, как описано в шаге 1.2.3.
   4. Настройте параметры узла.
      1. В настройках узла Square_Targeting убедитесь, что установлены флажки Сортировать цели по кратчайшему пути и Включить автоматическое нацеливание (дополнительный рисунок 1A).
      2. В настройках узла Square убедитесь, что установлен флажок Ждать обработки изображения нодом. Добавьте пресет «Квадрат» в список справа от выпадающего меню, если его там еще нет. В разделе «Расширенные настройки» установите эти значения диафрагмы во время съемки и убедитесь, что значения для двух диафрагм верны (дополнительный рисунок 1B).
      3. В настройках узла Hole_Targeting установите флажок Разрешить проверку пользователем выбранных целей. Снимите флажки Queue up targets и Skip automated hole finder (дополнительный рисунок 2A).
      4. В параметре Hole node (Узел отверстия) установите флажок Wait to a node (Ожидать обработки изображения узлом для обработки изображения), и предустановка Hole (Отверстие) появится в списке справа. В разделе Дополнительные настройки установите эти значения диафрагмы во время съемки и убедитесь, что значения для двух диафрагм верны (дополнительный рисунок 2B).
      5. В настройках узла Exposure_Targeting установите флажок Разрешить проверку пользователем выбранных целей. Снимите флажки Ставить цели в очередь и Пропустить автоматический поиск отверстий (дополнительный рисунок 3A).
      6. В настройках узла Exposure (Экспозиция) убедитесь, что флажок Wait to a node to process the image (Ждать обработки изображения узлом для обработки изображения) снят, предустановка экспозиции указан справа, а в разделе Advanced settings (Расширенные настройки) установите флажок установить эти диафрагмы во время съемки и убедитесь, что значения для двух диафрагм верны (дополнительный рисунок 3B).
      7. В настройках узла Focus (Фокусировка) убедитесь, что флажок Wait to a node to processing the image (Ожидание узла для обработки изображения) снят, предустановка автофокусировки указана справа, а для параметра Желаемая точность автофокусировки (Desired autofocus accuracy) установлено значение 4 x 10^–6 м (дополнительный рисунок 4A).
      8. В узле Focus Sequence (рядом с кнопкой настроек) включите только два шага автофокусировки Beam Tilt (Наклон луча) (Дополнительный рисунок 4B,C).
      9. В настройках узла Z_Focus убедитесь, что флажок Ждать обработки изображения узлом снят, предустановка Отверстие указана справа, а Требуемая точность автофокусировки составляет 5 x ^10-5 м (дополнительный рисунок 5A).
      10. В Z_Focus узле Focus Sequence (Последовательность фокусировки) включите только два шага наклона предметного столика с малым увеличением (дополнительный рисунок 5B, C).
   5. Определите z-высоту сетки, как описано в шаге 1.2.4.
   6. Соберите атлас, как описано в шаге 1.2.10.
   7. Настройте параметры квадратного искателя.
      1. После того, как атлас будет собран, Птолемей найдет квадраты в Square_Targeting узле. В каждом квадрате будет синий круг, называемый кляксой. При наведении курсора на каждый сгусток Leginon сообщит об их размере, рассчитанном Птолемеем. Обратите внимание на самые большие и самые маленькие большие двоичные объекты.
      2. В настройках Порогового значения измените минимальный и максимальный диапазон фильтра, чтобы включить желательные квадраты и исключить нежелательные квадраты.
      3. Нажмите кнопку «Найти квадраты» на верхней панели инструментов. Отрегулируйте диапазон фильтра до тех пор, пока Find Squares (Найти квадраты) не станет полноценной целью.
      4. В настройках сбора выберите значения для параметров Максимальное количество целей и Количество целевых групп для выборки. Эти параметры будут определять, сколько квадратов и групп квадратов будут целевыми.
      5. После того, как параметры будут удовлетворены, нажмите кнопку «Воспроизвести ». Пример атласа после настройки показан на дополнительном рисунке 6.
   8. Настройте параметры эхолота.
      1. В узле Hole_Targeting используйте линейку , чтобы измерить диаметр отверстия.
      2. В настройках шаблона введите диаметр в поле Окончательный диаметр шаблона и нажмите кнопку Испытать. Отрегулируйте диаметр до тех пор, пока все отверстия не будут иметь ярко-белые пики в центре.
      3. В настройках порога нажмите кнопку Тест. Изменяйте значение A до тех пор, пока на бинаризованном изображении не будут видны белые области только там, где расположены отверстия.
      4. В параметрах "Большие двоичные объекты" выберите исключение целевых объектов "Граница " с помощью линейки для определения минимального расстояния от края и ввода этого значения. Большие двоичные объекты можно отфильтровать по размеру, округлости и желаемому количеству. Наведите курсор на большие двоичные объекты, чтобы отобразить их значения. Нажмите кнопку Тест , чтобы проверить текущие значения.
      5. В настройках решетки введите радиус отверстий и расстояние между отверстиями (используйте измерительный инструмент), затем нажмите кнопку 42 , чтобы измерить значение опорной интенсивности вакуумной области (пустое отверстие или разорванная опорная пленка).
      6. В настройках сбора данных установите флажок Использовать подмножество целевых объектов сбора данных и задайте для параметра Максимальное значение выборки (Sample Maximal) небольшое число, например 2. Установите широкий диапазон средних значений толщины льда и стандартных отклонений (измеряйте эти значения, наводя курсор на цели). Нажмите кнопку Тестовый таргетинг , чтобы случайным образом выбрать цель с учетом приведенных выше значений.
      7. Нажмите кнопку «Воспроизвести», когда все настройки будут удовлетворены. Легинон выполнит этап Z_Focus и соберет первую мишень. Пример изображения после установки показан на дополнительном рисунке 7.
   9. Настройте параметры таргетинга экспозиции.
      1. В настройках Hole (Отверстие) задайте для Shell Script путь к hl_finding.sh скрипту в установке Ptolemy. Установите минимальный балл для принятия равным ≤0. Введите радиус отверстий (используйте измерительный инструмент), затем нажмите кнопку 42 , чтобы измерить эталонное значение интенсивности вакуумной области (пустое отверстие или разорванная опорная пленка). Нажмите кнопку Тест , чтобы найти решетку отверстий.
      2. В настройках сбора данных установите флажок Использовать подмножество целей сбора и установите значение Максимум выборки на небольшое число, например 4, для сбора данных на подмножестве отверстий для экранирования. Установите широкий диапазон средних значений толщины льда и стандартных отклонений (измеряйте эти значения, наводя курсор на цели).
      3. Нажмите кнопку «Воспроизвести», когда все настройки будут удовлетворены. Leginon будет выполнять эвцентрический фокус и собирать изображения с большим увеличением, которые можно увидеть в узле Exposure . Пример изображения после установки показан на дополнительном рисунке 8.
   10. Проверьте следующее Exposure_Targeting изображение, чтобы убедиться, что приведенных выше настроек по-прежнему достаточно. После этого снимите флажок «Разрешить пользовательскую проверку выбранных целей » в настройках «Нацеливание экспозиции » и «Нацеливание на отверстие».
       ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь скрининг должен выполняться автоматически для текущей сетки. Этот сеанс будет использоваться в качестве шаблонного сеанса для всех сеток.
2. После того, как сетка завершит экранирование, нажмите «Файл» > «Выход», чтобы закрыть Leginon.
3. Настройка Smart Leginon Autoscreen
   1. В окне терминала выполните autoscreen.py Smart Leginon.
   2. Выберите графический интерфейс, введите разделенный запятыми список слотов сетки для экрана, введите полный для рабочего процесса, введите имя шаблона сеанса, на котором будут основываться новые сеансы (его можно найти в Appion imageviewer), и введите значение z-height сеанса шаблона (дополнительный рисунок 9).
   3. Откроется графический интерфейс, позволяющий ввести имя сеанса для каждой сетки и выбрать соответствующие ассоциации проекта (дополнительный рисунок 10).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Smart Leginon Autoscreen теперь будет использовать настройки сеанса шаблона для автоматического скрининга каждой сетки и переключения между сетками без присмотра.
   4. Следите за сбором в Leginon, Appion и компьютере микроскопа или оставьте микроскоп без присмотра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как все сетки будут экранированы, Smart Leginon закроет клапаны колонки на микроскопе.

Discussion

В этом протоколе мы опишем конвейер для Smart Leginon Autoscreen, а также основы использования Leginon для тех, кто не знаком с программным обеспечением для сбора данных. Ожидается, что к концу 2024 г. криоЭМ с одной частицей станет самым продуктивным трехмерным (3D) методом разрешения структуры белков¹⁷. Конвейер криоЭМ с одной частицей состоит из нескольких этапов, которые постоянно оптимизируются для повышения качества данных и пропускной способности. На рисунке 2 показаны наиболее распространенные этапы (подготовка образца, подготовка сетки, время и трудозатраты на просеивание, время сбора данных с высоким разрешением, обработка в реальном времени и полная постобработка), а также другие компоненты конвейера, которые могут быть улучшены (доступ к скрининговому микроскопу, скорость и точность стола, скорость камеры и доступ к микроскопу высокого разрешения). Результаты большинства шагов становятся петлями обратной связи с предыдущими шагами (синие стрелки на рисунке 2), что делает весь конвейер сильно взаимозависимым. Каждый шаг на рисунке 2 выделен цветом, чтобы приблизительно показать, насколько узким местом является этот шаг по сравнению с другими. Smart Leginon Autoscreen значительно сокращает время и усилия оператора при просеивании 12 сеток с 6 часов до менее чем 10 минут, тем самым устраняя это узкое место и обеспечивая более быструю обратную связь при подготовке пробы/сетки (рис. 3).

Протокол состоит из нескольких критических этапов, показанных на рисунке 1. Очень важно, чтобы сетка, используемая для создания сеанса шаблона, была репрезентативной по отношению к остальным сеткам, подлежащим скринингу. Важно отметить, что Leginon запоминает все настройки на протяжении всего процесса настройки для создания шаблонного сеанса (синие шаги на рисунке 1), что позволяет каждый раз быстрее настраивать повторяющиеся сеансы шаблона. При создании шаблона сеанса наиболее важным шагом является настройка таргетинга на все увеличения, чтобы параметры и пороговые значения отражали ожидаемое изменение по экранируемым сеткам. Различные кнопки «Тест» обеспечивают эффективность процесса настройки. Во время сеанса Autoscreen очень важно следить за первыми несколькими сетками в Appion, чтобы быстро обнаружить любые проблемы и исправить их в Leginon как можно скорее.

Типичный рабочий процесс в SEMC заключается в передаче данных Autoscreen в CryoSPARC Live¹⁸ и использовании этой дополнительной информации для информирования циклов обратной связи при подготовке образца/сетки. Во время интенсивных дней оптимизации криоЭМ для исследователей и операторов информация о состоянии образца и сетки возвращается в подготовку образца и сетки, в то время как Autoscreen по-прежнему просеивает сетки. Это позволяет замораживать и просеивать несколько десятков сеток за^{неделю 8}.

Smart Leginon Autoscreen работает для большинства (80%-90%) дырявых сеток и условий, наблюдаемых в SEMC. Остальные 10%-20% сеток включают в себя те, которые иногда плохо работают - сетки с минимальной разницей контрастов между отверстиями и подложкой; сетки с меньшими отверстиями и интервалами (например, 0,6/0,8) - и сетки, где нацеливание на несколько сеток часто непрактично - сетки Spotiton/Chameleon^19,20, состоящие из полос выборки по всей сетке; Кружевные сетки. Обратите внимание, что коллекция наклонной сетки с автоэкраном находится в разработке, но пока недоступна. Возможно, можно модифицировать протокол для работы с сетками Spotiton/Chameleon, сначала визуализируя области полосы вручную для определения узких пороговых значений параметров, затем пытаясь сгруппировать большие и меньшие квадраты вместе, соответственно, на шаге 2.1.7.4, а затем выбирая цели из группы с помощью льда. Цель этой модификации состоит в том, чтобы Smart Leginon разделил пустые и непустые квадраты на две группы. Если параметры найдены, они могут плохо распространяться на остальные сетки, подлежащие экранированию. Также можно модифицировать протокол для работы с сетками Лейси, удалив сценарий hl_finding.sh на шаге 2.1.9.1 и настроив параметры для более светлых/темных областей по желанию. Успешность этой модификации может варьироваться от сетки к сетке в зависимости от толщины льда и материала сетки.

Устранение неполадок во время сеанса автоэкрана возможно, а иногда и целесообразно. Изменения в предустановленных (например, расфокусировка) и целевых параметрах (например, пороговые значения Hole Target) могут быть внесены во время автоматического сбора. Во время сбора данных сеанс Autoscreen сеанс сетки не может быть отменен, так как он завершит autoscreen.py. Однако кнопки «Прервать» в узлах «Нацеливание» можно использовать для пропуска любой части сетки или всей сетки. Иногда autoscreen.py может использовать слишком много памяти и замораживать, предлагая два варианта: «принудительный выход» или «ожидание». Если выбран параметр «Принудительный выход», весь сценарий завершится, что потребует от пользователя повторного запуска сценария, который будет применен к оставшимся сеткам для скрининга. Если выбрано 'wait', сценарий продолжится, и настройки могут быть изменены для предотвращения зависания в будущем, например, отключение отображения изображения в узле Exposure, уменьшение размера пикселя в атласе или запуск скрипта очистки памяти. Если программа зависает, не предлагая двух вариантов, ошибки памяти могут не разрешиться сами по себе, что приведет к паузе в сборе данных. В этом случае может быть полезна опция «принудительного выхода».

Smart Leginon Autoscreen регулярно используется в SEMC. По мере того, как узкие места в конвейере одночастичных криоЭМ продолжают сокращаться, внедрение криоЭМ будет продолжать расти, чтобы помочь ответить на биологические вопросы. Данный протокол является шагом в направлении оптимизации всего пайплайна, предоставляя четкий путь для значительного сокращения циклов обратной связи.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacios cryoTEM	Thermo Fisher Scientific	GLACIOSTEM	FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera
Krios cryoTEM	Thermo Fisher Scientific	KRIOSG4TEM	XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera
Leginon	Simons Electron Microscopy Center		http://leginon.org
Ptolemy	Simons Machine Learning Center		https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy