Metabolômica Arteriovenosa para Mensuração da Troca de Metabólitos In Vivo no Tecido Adiposo Marrom

Summary

Neste protocolo, métodos relevantes para metabolômica arteriovenosa otimizada para BAT usando GC-MS em um modelo de camundongo são descritos. Esses métodos permitem a aquisição de informações valiosas sobre a troca de metabólitos mediada por MTD em nível de organismo.

Abstract

O tecido adiposo marrom (BAT) desempenha um papel crucial na regulação da homeostase metabólica através de um processo único de gasto energético conhecido como termogênese sem tremores. Para conseguir isso, a BAT utiliza um cardápio diversificado de nutrientes circulantes para suportar sua alta demanda metabólica. Além disso, a MTD secreta fatores bioativos derivados de metabólitos que podem servir como combustíveis metabólicos ou moléculas sinalizadoras, facilitando a comunicação intratecidual e/ou intertecidual mediada por BAT. Isso sugere que a MTD participa ativamente na troca de metabólitos sistêmicos, uma característica interessante que está começando a ser explorada. Aqui, apresentamos um protocolo para metbolômica arteriovenosa BAT otimizada em nível de camundongo in vivo . O protocolo se concentra em métodos relevantes para estimulações termogênicas e uma técnica de coleta de sangue arteriovenoso usando a veia de Sulzer, que drena seletivamente o sangue venoso interescapular derivado do BAT e o sangue arterial sistêmico. Em seguida, um protocolo metabolômico baseado em cromatografia gasosa usando essas amostras de sangue é demonstrado. O uso desta técnica deve expandir a compreensão da troca de metabólitos regulados por MTD em nível inter-órgão, medindo a captação líquida e liberação de metabólitos por BAT.

Introduction

O tecido adiposo marrom (BAT) possui uma propriedade única de gasto energético conhecida como termogênese sem tremores (NST), que envolve mecanismos dependentes da proteína desacopladora mitocondrial 1 (UCP1) e independentes de UCP1 1,2,3,4,5. Essas características distintas implicam MTD na regulação do metabolismo sistêmico e na patogênese de doenças metabólicas, incluindo obesidade, diabetes tipo 2, doença cardiovascular e caquexia por câncer ^6,7,8<....

Protocol

Todos os experimentos foram conduzidos com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sungkyunkwan (IACUC). Os camundongos foram alojados em um biotério aprovado pela IACUC, localizado em uma sala limpa regulada para 22 °C e 45% de umidade, após um ciclo claro/escuro diário de 12 horas. Eles foram mantidos em racks ventilados e tiveram acesso a uma dieta padrão de ração ad libitum (composta por 60% de carboidratos, 16% de proteínas e 3% de gorduras). Os materiais de cam.......

Discussion

Um passo crítico na compreensão do potencial metabólico da MTD no balanço energético de todo o corpo é definir quais nutrientes ela consome, como eles são processados metabolicamente e quais metabólitos são liberados na circulação. Esse protocolo introduz uma técnica especializada em amostragem arteriovenosa que permite o acesso à vasculatura venosa das MTD interescapulares e da vasculatura arterial sistêmica em camundongos C57BL/6J, recentemente desenvolvida e validada por Park e^cols.42

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-20 µL Filter Tips	Axygen	AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"	BD Biosciences	309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)	Agilent	G7077B
Agilent 7693A Autosampler	Agilent	G4513A
Agilent 8890 GC System	Agilent	G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI	Agilent	19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)	Agilent	G3335-90240
C57BL/6J mouse	DBL	C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)	LABCONCO	7811041
DL-Norvaline	Sigma-Aldrich	N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Glass insert 250 μL	Agilent	5181-1270
Methanol (LC-MS grade)	Sigma-Aldrich	Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base	Sarstedt	20.1290.100
MTBSTFA	Sigma-Aldrich	394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)	Sigma-Aldrich	270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators	LABCONCO	7310041
Rodent diet	SAFE	SAFE R+40-10
Rodent incubator	Power scientific	RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"	BD Biosciences	328203
Vial Cap 9 mm	Agilent	5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL	Agilent	5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40	Axygen	PCR-02-C