Imaging a montaggio completo per visualizzare e quantificare la struttura periferica del cristallino, la morfologia e l'organizzazione cellulare

I presenti protocolli descrivono nuove immagini a montaggio intero per la visualizzazione di strutture periferiche nel cristallino oculare con metodi per la quantificazione dell'immagine. Questi protocolli possono essere utilizzati negli studi per comprendere meglio la relazione tra le strutture su microscala delle lenti e lo sviluppo/funzione delle lenti.

Il cristallino oculare è un tessuto trasparente e flessibile che altera la sua forma per focalizzare la luce da diverse distanze sulla retina. A parte una membrana basale che circonda l'organo, chiamata capsula, il cristallino è interamente cellulare costituito da un monostrato di cellule epiteliali sull'emisfero anteriore e da una massa di cellule in fibra del cristallino. Nel corso della vita, le cellule epiteliali proliferano nella zona germinativa all'equatore del cristallino e le cellule epiteliali equatoriali migrano, si allungano e si differenziano in cellule fibrose di nuova formazione. Le cellule epiteliali equatoriali alterano sostanzialmente la morfologia da cellule a forma di ciottoli impacchettate in modo casuale in cellule a forma di esagono allineate che formano file meridionali. Le cellule delle fibre del cristallino appena formate mantengono la forma esagonale della cellula e si allungano verso i poli anteriore e posteriore, formando un nuovo guscio di cellule che si sovrappongono alle precedenti generazioni di fibre. Poco si sa sui meccanismi che guidano la notevole morfogenesi delle cellule epiteliali del cristallino in cellule fibrose. Per comprendere meglio la struttura, lo sviluppo e la funzione delle lenti, sono stati sviluppati nuovi protocolli di imaging per l'imaging delle strutture periferiche utilizzando interi supporti di lenti oculari. Qui vengono mostrati i metodi per quantificare lo spessore della capsula, l'area delle cellule epiteliali, l'area e la forma del nucleo cellulare, l'ordine e l'impacchettamento delle cellule della fila meridionale e le larghezze delle cellule delle fibre. Queste misurazioni sono essenziali per chiarire i cambiamenti cellulari che si verificano durante la crescita del cristallino per tutta la vita e comprendere i cambiamenti che si verificano con l'età o la patologia.

Il cristallino oculare è un tessuto flessibile e trasparente situato nella regione anteriore dell'occhio che funziona per focalizzare finemente la luce sulla retina. La capacità di funzionamento dell'obiettivo può essere attribuita, in parte, alla sua intricata architettura e organizzazione 1,2,3,4,5,6. Intorno al tessuto del cristallino c'è la capsula, una membrana basale essenziale per mantenere la struttura del cristallino e le proprietà biomecca....

I topi sono ospitati nella struttura per animali dell'Università del Delaware, mantenuti in un ambiente privo di agenti patogeni. Tutte le procedure sugli animali, compresa l'eutanasia per inalazione di CO₂ , sono state condotte in conformità con i protocolli sugli animali approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Delaware.

1. Preparazione e imaging dell'intero innesto dell'obiettivo

1. Fissaggio di lenti per l'.......

Capsula anteriore del cristallino, area delle cellule epiteliali e area nucleare
Per analizzare lo spessore della capsula dell'obiettivo, abbiamo colorato le capsule dell'obiettivo, in lenti live o fisse, con WGA. Abbiamo identificato le cellule epiteliali del cristallino marcando le membrane con tdTomato in lenti vive (Figura 2A) o tramite la colorazione rodamina-falloidina per la F-actina sulle membrane cellulari nelle lenti fisse (Figura 2B

I protocolli descritti consentono la visualizzazione ad alta risoluzione spaziale delle strutture e delle cellule periferiche del cristallino nelle regioni anteriori ed equatoriali del cristallino. In questo studio, sono stati mostrati metodi per la visualizzazione di strutture periferiche dell'obiettivo utilizzando lenti intatte (sotto tensione o fisse) in cui l'architettura complessiva dell'obiettivo 3D è preservata. Inoltre, sono stati forniti metodi semplici per l'analisi quantitativa morfometrica utilizzando il sof.......

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Eye Institute Grant R01 EY032056 to CC e R01 EY017724 al VMF, nonché dal National Institute of General Medical Sciences con il numero di sovvenzione P20GM139760. S.T.I è stato supportato da NIH-NIGMS T32-GM133395 come parte del programma di formazione pre-dottorato Chemistry-Biology Interface e da un premio per studiosi laureati dell'Università del Delaware.