Imagens de montagem completa para visualizar e quantificar a estrutura da lente periférica, a morfologia e a organização da célula

Summary

Os protocolos descritos são novos métodos de visualização de estruturas periféricas na lente ocular com métodos de quantificação de imagens. Estes protocolos podem ser utilizados em estudos para melhor compreender a relação entre as estruturas da microescala do cristalino e o desenvolvimento/função do cristalino.

Abstract

A lente ocular é um tecido flexível transparente que altera sua forma para focalizar a luz de diferentes distâncias na retina. Além de uma membrana basal que envolve o órgão, chamada de cápsula, o cristalino é inteiramente celular consistindo de uma monocamada de células epiteliais no hemisfério anterior e uma massa volumosa de células de fibra do cristalino. Ao longo da vida, as células epiteliais proliferam na zona germinativa no equador do cristalino, e as células epiteliais equatoriais migram, alongam-se e diferenciam-se em células de fibras recém-formadas. As células epiteliais equatoriais alteram substancialmente a morfologia de células em forma de paralelepípedo aleatoriamente embaladas em células alinhadas em forma de hexágono formando fileiras meridionais. As células de fibras do cristalino recém-formadas retêm a forma de célula hexagonal e se alongam em direção aos polos anterior e posterior, formando uma nova camada de células que são sobrepostas às gerações anteriores de fibras. Pouco se sabe sobre os mecanismos que conduzem a notável morfogênese das células epiteliais do cristalino para as células fibrosas. Para melhor entender a estrutura, o desenvolvimento e a função das lentes, novos protocolos de imagem foram desenvolvidos para obter imagens de estruturas periféricas usando montagens inteiras de lentes oculares. Aqui, métodos para quantificar a espessura da cápsula, a área celular epitelial, a área e a forma nuclear da célula, a ordem e o empacotamento das células da linha meridional e as larguras das células de fibra são mostrados. Essas medidas são essenciais para elucidar as mudanças celulares que ocorrem durante o crescimento do cristalino ao longo da vida e entender as mudanças que ocorrem com a idade ou patologia.

Introduction

A lente ocular é um tecido flexível e transparente situado na região anterior do olho que tem a função de focalizar a luz na retina. A capacidade de funcionamento da lente pode ser atribuída, em parte, à sua intrincada arquitetura e organização 1,2,3,4,5,6. Ao redor do tecido do cristalino encontra-se a cápsula, membrana basal essencial para a manutenção da estrutura e das propriedades biomecânicas^do cristalino ^7,8,9

Protocol

Os camundongos são alojados na instalação animal da Universidade de Delaware, mantidos em um ambiente livre de patógenos. Todos os procedimentos em animais, incluindo a eutanásia por inalação de CO₂ , foram conduzidos de acordo com protocolos animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Delaware (IACUC).

1. Preparação e imagem da montagem completa da lente

1. Fixação de lentes para imagens de montagem.......

Discussion

Os protocolos descritos permitem a visualização em alta resolução espacial das estruturas e células periféricas do cristalino nas regiões anterior e equatorial do cristalino. Neste estudo, métodos para a visualização das estruturas periféricas das lentes usando lentes intactas (vivas ou fixas) onde a arquitetura geral da lente 3D é preservada foram mostrados. Adicionalmente, métodos simples para análise morfométrica quantitativa usando o software FIJI ImageJ disponível publicamente foram fornecidos. Os m?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimycotic/Antibiotic	Cytiva	SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Prometheus	25-529
Delicate task wipes	Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laser scanning confocal Microscope 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Phenol red-free medium 199	Gibco	11043023
Rhodamine-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R