Isolamento in un'unica fase di vescicole extracellulari da campioni di grande volume con un dispositivo microfluidico A4F biforcato

Summary

Le vescicole extracellulari sono estremamente promettenti per le applicazioni biomediche, ma gli attuali metodi di isolamento richiedono molto tempo e non sono pratici per l'uso clinico. In questo studio, presentiamo un dispositivo microfluidico che consente l'isolamento diretto di vescicole extracellulari da grandi volumi di biofluidi in modo continuo con passaggi minimi.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) hanno un immenso potenziale per varie applicazioni biomediche, tra cui la diagnostica, la somministrazione di farmaci e la medicina rigenerativa. Tuttavia, le attuali metodologie per isolare i veicoli elettrici presentano sfide significative, come la complessità, il consumo di tempo e la necessità di apparecchiature ingombranti, che ostacolano la loro traduzione clinica. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo mirato a sviluppare un innovativo sistema microfluidico basato su copolimero olefinico ciclico fuori stechiometria tiolo-ene (COC-OSTE) per l'isolamento efficiente di EV da campioni di grandi volumi in modo continuo. Utilizzando la separazione basata sulle dimensioni e sulla galleggiabilità, la tecnologia utilizzata in questo studio ha ottenuto una distribuzione dimensionale significativamente più stretta rispetto agli approcci esistenti da campioni di urina e terreni cellulari, consentendo il targeting di specifiche frazioni di dimensioni EV in applicazioni future. Il nostro innovativo design del dispositivo microfluidico COC-OSTE, che utilizza la tecnologia di frazionamento del flusso di campo a flusso asimmetrico biforcato, offre un approccio di isolamento EV semplice e continuo per campioni di grandi volumi. Inoltre, il potenziale per la produzione di massa di questo dispositivo microfluidico offre scalabilità e coerenza, rendendo fattibile l'integrazione dell'isolamento delle vescicole extracellulari nella diagnostica clinica di routine e nei processi industriali, dove l'elevata coerenza e produttività sono requisiti essenziali.

Introduction

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle legate alla membrana derivate dalle cellule che comprendono due tipi principali: esosomi (30-200 nm) e microvescicole (200-1000 nm)¹. Gli esosomi si formano attraverso la gemmazione verso l'interno della membrana endosomiale all'interno di un corpo multivescicolare (MVB), rilasciando vescicole intraluminali (ILV) nello spazio extracellulare dopo la fusione con la membrana plasmatica¹. Al contrario, le microvescicole sono generate dalla gemmazione verso l'esterno e dalla fissione della membrana cellulare². Le vescicole extracellulari svolgono un ruol....

Protocol

La raccolta dei campioni è stata approvata dal Comitato etico per la ricerca sulle scienze mediche e della vita dell'Università lettone (decisione N0-71-35/54)

NOTA: I materiali utilizzati in questo studio sono inclusi nel file Tabella dei materiali .

1. Fabbricazione di stampi stampati tridimensionali (3D)

1. Progettare uno stampo doppio negativo a forma di serpentina in un software CAD con le seguenti dimensioni per il ca.......

Discussion

Il dispositivo microfluidico presentato offre un metodo promettente per l'isolamento e l'estrazione di vescicole extracellulari da fluidi biologici, affrontando alcuni dei limiti critici dei metodi gold standard esistenti come UC e SEC¹². UC e SEC sono noti per essere laboriosi, dispendiosi in termini di tempo e soffrono di un basso rendimento, il che li rende meno adatti per applicazioni ad alto rendimento in cui sono necessarie grandi quantità di veicoli elettrici^21,22

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm carboxylate FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubes	Starstedt	72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needle	RAYS	TUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettes	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters	Merck Millipore	UFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubes	Eppendorf	30108132
20 mL syringes	BD PlastikPak	10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubing	Darwin Microfluidics	CIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter units	Merck Millipore,	UFC200324
5 mL Medical Syringe without Needle	Anhui Hongyu Wuzhou Medical	159646
50 mL conical tubes	Sarstedt	62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing	Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. binding	Greiner Bio-One	655001	ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Topas microscopy slide platform	Microfluidic Chipshop	10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer	Microfluidic Chipshop	10000387
Elveflow OB1 pressure controller	Elvesys Group
Luer connectors	Darwin Microfluidics	CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6	SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300	nanoparticle analyzer
Optical microscope Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g	Fisher Scientific	BP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density)	it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterile	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm column	Izon	SP5	SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer Kit	PP&S
Resin Tough Black	Zortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	331301
Syringe pump	DK Infusetek	ISPLab002
T175 suspension flask	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-Fc protein	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)	SigmaAldrich	T0440-100ML	Horseradish peroxidase substrate
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XP	Beckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek instruments	71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterile	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe Filter	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		dynamic light scattering (DLS) system
Zortrax Inkspire	Zortrax