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Usando imagens ao vivo ex vivo para investigar divisões celulares e movimentos durante a renovação dentária de camundongos
In This Article
Summary
A imagem ao vivo ex vivo é uma técnica poderosa para estudar os processos dinâmicos de movimentos celulares e interações em tecidos vivos. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa microscopia de dois fótons para rastrear células epiteliais dentárias vivas em incisivos adultos inteiros cultivados.
Abstract
O incisivo de camundongo em crescimento contínuo está emergindo como um sistema modelo altamente tratável para investigar a regulação de células-tronco mesenquimais e epiteliais adultas e regeneração dentária. Essas populações progenitoras dividem, movem e diferenciam ativamente para manter a homeostase tecidual e regenerar as células perdidas de maneira responsiva. No entanto, as análises tradicionais usando cortes de tecido fixo não conseguiram capturar os processos dinâmicos dos movimentos e interações celulares, limitando nossa capacidade de estudar suas regulações. Este trabalho descreve um protocolo para manter incisivos inteiros de camundongos em um sistema de cultura de explantes e células epiteliais dentárias live-track usando microscopia timelapse multifóton. Esta técnica se soma à nossa caixa de ferramentas existente para pesquisa odontológica e permite que os pesquisadores adquiram informações espaço-temporais sobre comportamentos e organizações celulares em um tecido vivo. Antecipamos que esta metodologia ajudará os pesquisadores a explorar ainda mais os mecanismos que controlam os processos celulares dinâmicos que ocorrem durante a renovação e regeneração dentária.
Introduction
Nas últimas duas décadas, o incisivo de camundongo emergiu como uma plataforma inestimável para investigar os princípios da regulação de células-tronco adultas e regeneraçãodentária1,2. O incisivo de camundongo cresce continuamente e se renova ao longo da vida do animal. Para isso, mantém tanto as células-tronco epiteliais quanto as mesenquimais, que podem se auto-renovar e se diferenciar em diferentes tipos celulares do dente 1,2. Enquanto as células-tronco epiteliais dentárias dão origem aos ameloblastos, que secretam a matriz do esmalte, as células-....
Protocol
Todos os camundongos foram mantidos em instalações para animais livres de patógenos na Universidade da Califórnia em Los Angeles (UCLA) ou na Universidade Hebraica de Jerusalém (HUJI). Todos os experimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com normas e protocolos aprovados pela respectiva Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) ou (MD-23-17184-3; HUJI). Um fluxo de trabalho geral das etapas experimentais é mostrado na Figura 2A.......
Representative Results
A região apical do incisivo adulto de camundongo está envolta dentro da mandíbula (Figura 1) e, portanto, não é diretamente acessível para visualização e rastreamento vivo das células progenitoras que residem na região de crescimento. Portanto, desenvolvemos um método para extrair todo o incisivo do osso maxilar e mantê-lo em um sistema de cultura de explantes para microscopia timelapse de dois fótons (Figura 2). Descrevemos resultados representativ.......
Discussion
A imagem de tecidos vivos é uma importante técnica que permite estudar os processos dinâmicos e comportamentos das células quando mantidas em seu ambiente de nicho41. Idealmente, imagens ao vivo são realizadas in vivo com alta resolução espaço-temporal. No entanto, a obtenção de imagens in vivo para órgãos de mamíferos pode ser desafiadora devido à inacessibilidade tecidual, opacidade óptica e dificuldade de imobilização do animal ou do órgão por um período pr.......
Acknowledgements
Agradecemos ao Laboratório de Microscopia/Espectroscopia de Luz Avançada da UCLA e ao Centro de Excelência da Leica Microsystems no California NanoSystems Institute (RRID:SCR_022789) pelo fornecimento de microscopia de dois fótons. O AS foi apoiado pelo ISF 604-21 da Israel Science Foundation. A HA foi apoiada por R03DE030205 e R01DE030471 do NIH/NIDCR. AS e JH também foram apoiados por 2021007 de subsídios da Fundação Binacional de Ciência Estados Unidos-Israel (BSF).
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
References
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al.
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