Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במאמר זה אנו מתארים שיטת הומוגניזציה מהירה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) החולקים את אותו מקור ביולוגי ומבנה, מורפולוגיה והרכב חלבונים דומים של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות (EV).

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) משכו תשומת לב משמעותית במחקר פיזיולוגי ופתולוגי, אבחון מחלות וטיפול; עם זאת, התרגום הקליני שלהם הוגבל על ידי היעדר גישות ייצור בקנה מידה גדול. לכן, פרוטוקול זה מספק שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) הנגזר מהאנדוזומים, שיש להם תפוקה גבוהה פי 100 בערך משיטת אולטרה-צנטריפוגה קונבנציונלית. בשיטה זו, ננו-חלקיקים מגנטיים (MNPs) הופנמו על ידי תאי ההורים באמצעות אנדוציטוזה ולאחר מכן הצטברו בתוך האנדוזומים שלהם. לאחר מכן, אנדוזומים עמוסי MNPs נאספו וטוהרו על ידי טיפול היפוטוני והפרדה מגנטית. הומוגנייזר במהירות גבוהה שימש לפירוק אנדוזומים טעוני MNP לננו-שלפוחיות חד-פיזוריות. השלפוחיות שמקורן באנדוזום המתקבלות הן בעלות אותו מקור ביולוגי ומבנה, ומאופיינות בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת וכתם מערבי. המורפולוגיה והרכב החלבונים שלהם דומים לרכבים חשמליים מקומיים, מה שמצביע על כך ש- EMs עשויים לשמש כתחליף בעלות נמוכה ובתפוקה גבוהה של כלי רכב חשמליים מקוריים לתרגומים קליניים.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן שלפוחיות קטנות המופרשות כמעט על ידי כל התאים בטווח גדלים של 30-150 ננומטר, המכילות שפע של חומרים ביו-אקטיביים. בהתאם לתא המוצא, כלי רכב חשמליים מראים הטרוגניות גבוהה, בעלי רכיבים מרובים ספציפיים לתאי אב1. כלי רכב חשמליים משתחררים לנוזלי הגוף ומועברים לאתרים מרוחקים, שם הם נלקחים על ידי תאי מטרה לפעולה2, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לספק מגוון רחב של מולקולות ביו-אקטיביות ותרופות לתיקון רקמות, אבחון וטיפול בגידולים ומודולציה חיסונית 3,4. עם זאת, ננו-חלקיקים ביולוגיים אחרים (למשל, ליפופרוטאינים) וננו-שלפוחיות (למשל, כלי רכב חשמליים שמקורם במס....

Protocol

הערה: סכמה של השיטה מוצגת באיור 1.

1. הכנה ובידוד EM

  1. הפנמת תאים של MNPs
    1. תרבית תאים
      1. השהה 1 × 106 תאי גזע מזנכימליים של מח עצם חולדה (BMSC), 293T או תאי סרטן אפיתל של שחלות עכבר (ID8) ב- DMEM בינוני מלא עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו- 5% תמיסת פניצילין-סטרפטו?.......

Representative Results

זרימת העבודה של הכנת EM על-ידי הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית מוצגת באיור 1. תאים מפנימים IONPs מהונדסים בפוליליזין בגודל 10 ננומטר, אשר מצטברים באופן ספציפי באנדוזומים באמצעות אנדוציטוזה (איור 3A). לאחר שטופלו בחיץ היפוטוני והומוגני, האנדוזומים ט?.......

Discussion

כפונדקאית של טיפול ללא תאים ומערכת אספקת תרופות בקנה מידה ננומטרי, כלי רכב חשמליים עדיין לא עמדו בציפיות הקליניות שלהם, ומכשול עיקרי הוא היעדר שיטות ייצור וטיהור ניתנות להרחבה ולשחזור6. לכן, סוגים שונים של EMs פותחו כאנלוגים EV עם מורכבות ביולוגית דומה14. נכון להיום, .......

Acknowledgements

המחברים מודים על השימוש במכשירים במתקן הליבה של המכשור המשותף במכון לרפואה בסיסית וסרטן (IBMC), האקדמיה הסינית למדעים. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC; 82172598), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג, סין (LZ22H310001), פרויקט הכשרת כישרונות בריאות 551 של ועדת הבריאות של מחוז ג'ג'יאנג, סין, פרויקט המחקר לפיתוח חקלאי וחברתי של לשכת המדע והטכנולוגיה העירונית של האנגג'ואו (2022ZDSJ0474) ומענק המחקר הבין-תחומי Qiantang.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Annexin antibodyABclonalA11235Western blotting
BCA assay kitBeyotimeP0012Protein concentration assay
CalnexinGeneTexHL1598Western blotting
CD63 antibodyABclonalA19023Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IPBeyotimeP0013Western blotting
CentrifugeBeckmanAllegra X-30RCell centrifuge
CO2 incubatorThermoCell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopyNIKONA1 HD25Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)GIBCOC11995500BTCell culture
Dynamic light scattering (DLS)MalvernZetasizer Nano ZS ZEN3600Diameter analysis
Electric glass homogenizerSCIENTZ(Ningbo, China)DY89-IILow-speed homogenization
Exosome-depleted FBSsystem BioscienceEXO-FBS-50A-1Cell culture
High-speed homogenizerSCIENTZ(Ningbo, China)XHF-DYHigh-speed homogenization
Magnetic grateTuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)NAMagnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane LabelingSigma-AldrichPKH26GL-1KTThe kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs)Zhongke Leiming Technology (Beijing, China)Mag1100-10Cell culture
Potassium chlorideAladdin7447-40-7Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktailBeyotimeP1030Proteinase inhibitor
Sodium citrateAladdin7447-40-7Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM)JEOLJEM-2100plusMorphology image
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzersParticle MetrixPMX120Nanoparticle tracking analysis

References

  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
  2. Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. <....

Explore More Articles

JoVE203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved