יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה

Summary

היישום של שכבות תמיכה ברשתות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM) יכול להגדיל את צפיפות החלקיקים, להגביל אינטראקציות עם ממשק אוויר-מים, להפחית תנועה הנגרמת על ידי אלומה, ולשפר את התפלגות כיווני החלקיקים. מאמר זה מתאר פרוטוקול חזק לציפוי רשתות cryoEM בשכבה אחת של גרפן לשיפור הכנת דגימת קריו.

Abstract

במיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM), מקרומולקולות מטוהרות מיושמות על רשת הנושאת רדיד פחמן חור; לאחר מכן מכתימים את המולקולות כדי להסיר עודפי נוזל ומוקפאות במהירות בשכבה בעובי של 20-100 ננומטר של קרח זגוגית, המרחפים על פני חורי רדיד אלומיניום ברוחב של כ-1 מיקרומטר. הדגימה המתקבלת מצולמת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני, ולאחר עיבוד תמונה באמצעות תוכנה מתאימה, ניתן לקבוע מבנים ברזולוציה כמעט אטומית. למרות האימוץ הנרחב של cryoEM, הכנת הדגימות נותרה צוואר בקבוק חמור בתהליכי העבודה של cryoEM, כאשר משתמשים נתקלים לעתים קרובות באתגרים הקשורים לדגימות המתנהגות בצורה גרועה בקרח הזגוגית המרחף. לאחרונה פותחו שיטות לשינוי רשתות cryoEM עם שכבה רציפה אחת של גרפן, הפועלת כמשטח תמיכה שלעתים קרובות מגדיל את צפיפות החלקיקים באזור המצולם ויכול להפחית אינטראקציות בין חלקיקים לבין ממשק אוויר-מים. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים ליישום גרפן לרשתות cryoEM ולהערכה מהירה של ההידרופיליות היחסית של הרשתות המתקבלות. בנוסף, אנו מתארים שיטה מבוססת EM כדי לאשר את נוכחותו של גרפן על ידי הדמיה של דפוס עקיפה אופייני שלה. לבסוף, אנו מדגימים את התועלת של תמיכות גרפן אלה על ידי שחזור מהיר של מפת צפיפות ברזולוציה של 2.7 Å של קומפלקס Cas9 באמצעות מדגם טהור בריכוז נמוך יחסית.

Introduction

מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני של חלקיק יחיד (cryoEM) התפתח לשיטה נפוצה להדמיית מקרומולקולות ביולוגיות¹. מונע על ידי התקדמות בזיהוי אלקטרונים ישיר ^2,3,4, רכישת נתונים⁵, ואלגוריתמים לעיבוד תמונה ^6,7,8,9,10, cryoEM מסוגל כעת לייצר מבנים תלת-ממדיים ברזולוציה כמעט אטומית של מספר גדל במהירות של מקרומולקולות¹¹. יתר על כן, על ידי מינוף האופי המולקולרי הי....

Protocol

1. הכנת גרפן CVD

1. הכינו תמיסת תחריט גרפן כמתואר להלן.
   1. יש להמיס 4.6 גרם אמוניום פרסולפט (APS) ב-20 מ"ל מים באיכות מולקולרית במיכל של 50 מ"ל לקבלת תמיסה של 1 מ' ולכסות ברדיד אלומיניום. אפשר ל-APS להתמוסס לחלוטין תוך כדי המשך לשלב 1.2.
2. הכינו קטע של גרפן CVD לציפוי מתיל מתקרילט (MMA). ?.......

Discussion

הכנת דגימות CryoEM כרוכה בשורה של אתגרים טכניים, כאשר רוב זרימות העבודה דורשות מהחוקרים לתפעל ידנית רשתות שבריריות בזהירות רבה כדי להימנע מפגיעה בהן. בנוסף, ההתאמה של כל דגימה לוויטריפיקציה היא בלתי צפויה; חלקיקים מתקשרים לעתים קרובות עם ממשק אוויר-מים או עם רדיד התמיכה המוצק המכסה את הרשתות.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL beaker (3x)	Fisher	02-555-25B
50 mL beaker (2x)	Corning	1000-50
Acetone	Fisher	A949-4
Aluminum foil	Fisher	15-078-292
Ammonium persulfate	Fisher	(I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm	Mattek	PCS-1.5-5024
CVD graphene	Graphene Supermarket	CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger	Ted-Pella	91000S
Ethanol	Millipore-Sigma	1.11727
Flat-tip tweezers	Fisher	50-239-60
Glass cutter	Grainger	21UE26
Glass petri plate and cover	VWR	75845-544
Glass serological pipette	Fisher	13-676-34D
Grid Storage Case	EMS	71146-02
Hot plate	Fisher	07-770-108
Isopropanol	Sigma	W292907
Kimwipe	Fisher	06-666
Lab scissors	Fisher	13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6	Kayaku	MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water	Corning	46-000-CM
Negative action tweezers (2x)	Fisher	50-242-78
P20 pipette	Rainin	17014392
P200 pipette	Rainin	17008652
Parafilm	Fisher	13-374-12
Pipette tips	Rainin	30389291
Quantifoil grids with holey carbon	EMS	Q2100CR1
Spin coater	SetCas	KW-4A	with chuck SCA-19-23
Straightedge	ULINE	H-6560
Thermometer	Grainger	3LRD1
UV/Ozone cleaner	BioForce	SKU: PC440
Vacuum desiccator	Thomas Scientific	1159X11
Whatman paper	VWR	28297-216