חדירה חקלאית כפויה בוואקום עבור בצמח טרנספורמציה של צמחים סרבנים: קקאו כמקרה בוחן

Summary

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול הראשון לחדירת ואקום מקומית למחקרי in vivo של טרנספורמציה גנטית של צמחים גדולים. באמצעות מתודולוגיה זו, השגנו לראשונה את הטרנספורמציה הארעית של קקאו בתיווך אגרובקטריום בפלנטה .

Abstract

חולף בטרנספורמציה של צמח הוא חלופה מהירה וחסכונית לשינוי גנטי של צמחים. רוב הפרוטוקולים לטרנספורמציה של צמחים מסתמכים על שימוש בטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום. עם זאת, הפרוטוקולים הנמצאים בשימוש כיום הם סטנדרטיים עבור צמחים בגודל קטן בשל האילוצים הפיזיים והכלכליים של הגשת צמחים גדולים לטיפול ואקום. עבודה זו מציגה פרוטוקול יעיל לחדירה חקלאית מקומית מבוססת ואקום המותאמת לצמחים גדולים. כדי להעריך את יעילות השיטה המוצעת, בדקנו את השימוש בה בצמחי קקאו, מין צמח טרופי הסרבן לשינוי גנטי. הפרוטוקול שלנו איפשר להחיל ואקום של עד 0.07 מגפ"ס, עם חזרות, על חלק אווירי מקומי של עלי קקאו, מה שאיפשר לכפות חדירה של אגרובקטריום לחללים הבין-תאיים של עלים מחוברים. כתוצאה מכך, השגנו את הארעי בתיווך אגרובקטריום בטרנספורמציה צמחית של עלי קקאו מחוברים המבטאים עבור מערכת הכתבים של רובי. זהו גם האגרובקטריום הראשון בתיווך בטרנספורמציה חולפת של צמח הקקאו. פרוטוקול זה יאפשר ליישם את שיטת ההסתננות החקלאית מבוססת הוואקום על מיני צמחים אחרים בעלי מגבלות גודל דומות ויפתח את הדלת לאפיון גנים במינים עציים וגדולים סרבנים.

Introduction

שיטות טרנספורמציה גנטית של צמחים חיוניות לבדיקת התפקודים הביולוגיים של גנים והן שימושיות במיוחד כיום בהתחשב במספר הרב של גנים לא מאופיינים שנחזו בעידן הפוסט-גנומי¹. שיטות אלה יכולות לשמש להשגת קווים מותמרים במלואם או לבטא גנים באופן ארעי. טרנספורמציה יציבה מתרחשת כאשר הדנ"א הזר שהפונדקאי קלט משתלב באופן מלא ובלתי הפיך בגנום המארח, והשינויים הגנטיים מועברים לדורות הבאים. ביטוי חולף, המכונה טרנספורמציה חולפת, מתרחש מעותקים מרובים של T-DNA המועברים על ידי אגרובקטריום לתוך התא, שלא שולבו בגנום המארח, ומגיע לשיאו 2-4 ימים לאחר ההדבקה².

ראוי לציין כי מבחני ביטוי חולפים מספיקים לעתים קרובות....

Protocol

1. תרבות Agrobacterium tumefaciens

1. הפשירו תאים אלקטרוכשירים של זן Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
2. הוסף 1 מ"ל של מאלט שמרים (YM; טבלה 1) ציר לצינור תרבית בגודל 17 מ"מ x 100 מ"מ. שמור צינור זה למועד מאוחר יותר, ושמור אותו בטמפרטורת החדר (RT).
3. בצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל, הוסף 30 .......

Discussion

בעבודה זו הצגנו פרוטוקול יעיל ובעלות נמוכה של חלחול חקלאי לטרנספורמציה חולפת של צמחים עציים, תוך שימוש בצמחי קקאו כדוגמה. בהתחשב באילוץ הידוע שהקוטיקולה של העלים מייצגת לשינוי רקמות צמחים, התרכזנו בפיתוח אסטרטגיה שתקל על חלחול חקלאי על ידי ואקום בצמחים עציים, שהם בדרך כלל עקשנים להל?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L