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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Qui presentiamo il primo protocollo per l'infiltrazione sottovuoto localizzata per studi in vivo della trasformazione genetica di piante di grandi dimensioni. Utilizzando questa metodologia, abbiamo ottenuto per la prima volta la trasformazione transitoria del cacao mediata da Agrobacterium in planta .

Abstract

La trasformazione transitoria delle piante è un'alternativa rapida ed economica alla trasformazione genetica delle piante. La maggior parte dei protocolli per la trasformazione in planta si basa sull'uso della trasformazione mediata da Agrobacterium. Tuttavia, i protocolli attualmente in uso sono standardizzati per impianti di piccole dimensioni a causa dei vincoli fisici ed economici di sottoporre impianti di grandi dimensioni a un trattamento sottovuoto. Questo lavoro presenta un protocollo efficace per l'agroinfiltrazione localizzata sottovuoto personalizzata per impianti di grandi dimensioni. Per valutare l'efficacia del metodo proposto, ne abbiamo testato l'uso nelle piante di cacao, una specie vegetale tropicale recalcitrante alla trasformazione genetica. Il nostro protocollo ha permesso di applicare fino a 0,07 MPa di vuoto, con ripetizioni, su una parte aerea localizzata delle foglie di cacao, rendendo possibile l'infiltrazione di Agrobacterium negli spazi intercellulari delle foglie attaccate. Di conseguenza, abbiamo ottenuto il transiente mediato da Agrobacterium nella trasformazione planta delle foglie di cacao attaccate che si esprimono per il sistema reporter RUBY. Questa è anche la prima trasformazione transitoria del cacao mediata da Agrobacterium in planta . Questo protocollo consentirebbe l'applicazione del metodo di agroinfiltrazione basato sul vuoto ad altre specie vegetali con vincoli dimensionali simili e aprirebbe la porta alla caratterizzazione in pianta di geni in specie legnose recalcitranti di grandi dimensioni.

Introduction

I metodi di trasformazione genetica delle piante sono essenziali per testare le funzioni biologiche dei geni e sono particolarmente utili oggi, dato il gran numero di geni non caratterizzati previsti nell'era post-genomica1. Questi metodi possono essere utilizzati per ottenere linee completamente trasformate o per esprimere geni in modo transitorio. La trasformazione stabile si verifica quando il DNA estraneo che l'ospite ha assorbito diventa completamente e irreversibilmente integrato nel genoma dell'ospite e le modificazioni genetiche vengono trasmesse alle generazioni successive. L'espressione transitoria, nota come trasformazione transitori....

Protocol

1. Coltura di Agrobacterium tumefaciens

  1. Scongelare le cellule elettrocompetenti del ceppo Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
  2. Aggiungere 1 mL di Malto Lievitato (YM; Tabella 1) brodo in una provetta di coltura di 17 mm x 100 mm. Conservare questo tubo per dopo e conservarlo a temperatura ambiente (RT).
  3. In una provetta da 1,5 mL, aggiungere 30 μL di cellule di Agrobacterium scongelate e 100-250 ng (fino a 5 μL) di.......

Representative Results

Questo protocollo presenta un efficace metodo di agroinfiltrazione per piante legnose di grandi dimensioni. Con questo protocollo, siamo stati in grado di raggiungere una pressione del vuoto di -0,07 MPa, con conseguente infiltrazione efficace e localizzata delle foglie di cacao. Nella Figura 4, osserviamo il processo di impostazione del sistema di infiltrazione e nella Figura 5, la configurazione finale.

Discussion

In questo lavoro, abbiamo presentato un protocollo di agroinfiltrazione efficiente e a basso costo per la trasformazione transitoria in planta di piante legnose, utilizzando come esempio le piante di cacao. Dato il ben noto vincolo che la cuticola delle foglie rappresenta per la trasformazione dei tessuti vegetali, ci siamo concentrati sullo sviluppo di una strategia per facilitare l'agroinfiltrazione sottovuoto nelle piante legnose, che solitamente sono recalcitranti a questa procedura.

Disclosures

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Acknowledgements

Ringraziamo Lic. Jesús Fuentes González e Néstor Iván Robles Olivares per la loro assistenza nelle riprese del filmato. Riconosciamo le generose donazioni della Dott.ssa Antonia Gutierrez Mora di CIATEJ (piante di Theobroma cacao ). Ringraziamo anche CIATEJ e Laboratorio Nacional PlanTECC, Messico, per il supporto alla struttura. H.E.H.D. (CVU: 1135375) ha condotto studi di master con il finanziamento del Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, Messico (CONAHCYT). R.U.L. riconosce il sostegno del Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) e della Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, Messico (Grant ....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35S:RUBY plasmidAddgene160908http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvetteThermo Fisher Scientific FB101Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
DesiccatorBel-Art SP SCIENCEWARWEF42400-2121
Freeze dryerLABCONCO700402040
K2HPO4Sigma AldrichP8281-500GFor YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent AgrobacteriumIntact Genomics USA1285-12https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
MannitolSigma Aldrich63560-250G-FFor YM medium add 10 g/L
MESSigma AldrichPHG0003(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2Sigma AldrichM8266For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20Sigma Aldrich63138-1KGFor YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation ApparatusBiorad 165-2100
NaClKaral60552For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher Scientific 13-400-518
President Silicone Impression materialCOLTENE60019938
Rifampicin Gold-BioR-120-1(100 mg/mL)
Silicone Impression material gunAndentTBT06
SpectinomycinGold-BioS-140-SL10(100 mg/mL)
StreptomycinGold-BioS-150-SL10(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from caseinSigma Aldrich95039-1KG-FFor LB medium add 10 g/L
Yeast extractMCD LAB9031For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L

References

  1. Yang, J., Jia, M., Guo, J., Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , (2019).
  2. Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with ....

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