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Qui presentiamo il primo protocollo per l'infiltrazione sottovuoto localizzata per studi in vivo della trasformazione genetica di piante di grandi dimensioni. Utilizzando questa metodologia, abbiamo ottenuto per la prima volta la trasformazione transitoria del cacao mediata da Agrobacterium in planta .
La trasformazione transitoria delle piante è un'alternativa rapida ed economica alla trasformazione genetica delle piante. La maggior parte dei protocolli per la trasformazione in planta si basa sull'uso della trasformazione mediata da Agrobacterium. Tuttavia, i protocolli attualmente in uso sono standardizzati per impianti di piccole dimensioni a causa dei vincoli fisici ed economici di sottoporre impianti di grandi dimensioni a un trattamento sottovuoto. Questo lavoro presenta un protocollo efficace per l'agroinfiltrazione localizzata sottovuoto personalizzata per impianti di grandi dimensioni. Per valutare l'efficacia del metodo proposto, ne abbiamo testato l'uso nelle piante di cacao, una specie vegetale tropicale recalcitrante alla trasformazione genetica. Il nostro protocollo ha permesso di applicare fino a 0,07 MPa di vuoto, con ripetizioni, su una parte aerea localizzata delle foglie di cacao, rendendo possibile l'infiltrazione di Agrobacterium negli spazi intercellulari delle foglie attaccate. Di conseguenza, abbiamo ottenuto il transiente mediato da Agrobacterium nella trasformazione planta delle foglie di cacao attaccate che si esprimono per il sistema reporter RUBY. Questa è anche la prima trasformazione transitoria del cacao mediata da Agrobacterium in planta . Questo protocollo consentirebbe l'applicazione del metodo di agroinfiltrazione basato sul vuoto ad altre specie vegetali con vincoli dimensionali simili e aprirebbe la porta alla caratterizzazione in pianta di geni in specie legnose recalcitranti di grandi dimensioni.
I metodi di trasformazione genetica delle piante sono essenziali per testare le funzioni biologiche dei geni e sono particolarmente utili oggi, dato il gran numero di geni non caratterizzati previsti nell'era post-genomica1. Questi metodi possono essere utilizzati per ottenere linee completamente trasformate o per esprimere geni in modo transitorio. La trasformazione stabile si verifica quando il DNA estraneo che l'ospite ha assorbito diventa completamente e irreversibilmente integrato nel genoma dell'ospite e le modificazioni genetiche vengono trasmesse alle generazioni successive. L'espressione transitoria, nota come trasformazione transitori....
1. Coltura di Agrobacterium tumefaciens
Questo protocollo presenta un efficace metodo di agroinfiltrazione per piante legnose di grandi dimensioni. Con questo protocollo, siamo stati in grado di raggiungere una pressione del vuoto di -0,07 MPa, con conseguente infiltrazione efficace e localizzata delle foglie di cacao. Nella Figura 4, osserviamo il processo di impostazione del sistema di infiltrazione e nella Figura 5, la configurazione finale.
In questo lavoro, abbiamo presentato un protocollo di agroinfiltrazione efficiente e a basso costo per la trasformazione transitoria in planta di piante legnose, utilizzando come esempio le piante di cacao. Dato il ben noto vincolo che la cuticola delle foglie rappresenta per la trasformazione dei tessuti vegetali, ci siamo concentrati sullo sviluppo di una strategia per facilitare l'agroinfiltrazione sottovuoto nelle piante legnose, che solitamente sono recalcitranti a questa procedura.
Ringraziamo Lic. Jesús Fuentes González e Néstor Iván Robles Olivares per la loro assistenza nelle riprese del filmato. Riconosciamo le generose donazioni della Dott.ssa Antonia Gutierrez Mora di CIATEJ (piante di Theobroma cacao ). Ringraziamo anche CIATEJ e Laboratorio Nacional PlanTECC, Messico, per il supporto alla struttura. H.E.H.D. (CVU: 1135375) ha condotto studi di master con il finanziamento del Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, Messico (CONAHCYT). R.U.L. riconosce il sostegno del Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) e della Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, Messico (Grant ....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
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