Agroinfiltração Forçada a Vácuo para Transformação In planta de Plantas Recalcitrantes: Cacau como Estudo de Caso

Summary

Aqui, apresentamos o primeiro protocolo de infiltração localizada a vácuo para estudos in vivo da transformação genética de plantas de grande porte. Utilizando esta metodologia, obteve-se pela primeira vez a transformação transitória do cacau mediada por Agrobacterium em planta.

Abstract

A transformação transitória em plantas é uma alternativa rápida e econômica para a transformação genética de plantas. A maioria dos protocolos para transformação in planta depende do uso de transformação mediada por Agrobacterium. No entanto, os protocolos atualmente em uso são padronizados para plantas de pequeno porte devido às restrições físicas e econômicas de submeter plantas de grande porte a um tratamento a vácuo. Este trabalho apresenta um protocolo eficaz para agroinfiltração localizada a vácuo customizada para plantas de grande porte. Para avaliar a eficácia do método proposto, testou-se seu uso em plantas de cacau, uma espécie de planta tropical recalcitrante à transformação genética. Nosso protocolo permitiu aplicar até 0,07 MPa de vácuo, com repetições, em uma parte aérea localizada das folhas de cacau, tornando possível forçar a infiltração de Agrobacterium nos espaços intercelulares das folhas aderidas. Como resultado, obteve-se a transformação transitória em planta mediada por Agrobacterium de folhas de cacau anexas expressando para o sistema repórter RUBI. Esta é também a primeira Agrobacterium-mediada em planta de transformação transitória do cacau. Este protocolo permitiria a aplicação do método de agroinfiltração a vácuo a outras espécies vegetais com restrições de tamanho semelhantes e abriria as portas para a caracterização in planta de genes em espécies lenhosas recalcitrantes de grande porte.

Introduction

Métodos de transformação genética vegetal são essenciais para testar as funções biológicas dos genes e são especialmente úteis nos dias de hoje, dado o grande número de genes não caracterizados previstos na era pós-genômica¹. Estes métodos podem ser usados para obter linhas totalmente transformadas ou para expressar genes transitoriamente. A transformação estável ocorre quando o DNA estranho que o hospedeiro absorveu torna-se total e irreversivelmente integrado ao genoma do hospedeiro, e as modificações genéticas são transmitidas para as gerações seguintes. A expressão transitória, conhecida como transformação transitória, ocorre a partir de mú....

Protocol

1. Cultura de Agrobacterium tumefaciens

1. Descongelar células eletrocompetentes da cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
2. Adicionar 1 mL de malte de levedura (YM; Tabela 1) caldo para um tubo de cultura de 17 mm x 100 mm. Guarde este tubo para mais tarde e mantenha-o à temperatura ambiente (RT).
3. Em um tubo de microfuga de 1,5 mL, adicionar 30 μL das células de Agrobacterium descongeladas e 100-250 ng (até 5 μ.......

Discussion

Neste trabalho, apresentamos um protocolo de agroinfiltração eficiente e de baixo custo para a transformação transitória in planta de plantas lenhosas, usando como exemplo plantas de cacau. Dada a conhecida restrição que a cutícula das folhas representa para a transformação dos tecidos vegetais, concentramo-nos no desenvolvimento de uma estratégia para facilitar a agroinfiltração por vácuo em plantas lenhosas, que geralmente são recalcitrantes a esse procedimento.

A pre.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L