Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы представляем первый протокол локализованной вакуумной инфильтрации для исследований in vivo генетической трансформации крупномерных растений. Используя эту методологию, мы впервые добились Agrobacterium-опосредованной в planta транзиторной трансформации какао.

Abstract

Переходная трансформация растений является быстрой и экономичной альтернативой генетической трансформации растений. Большинство протоколов трансформации in planta основаны на использовании трансформации, опосредованной агробактериями. Тем не менее, используемые в настоящее время протоколы стандартизированы для малогабаритных установок из-за физических и экономических ограничений, связанных с вакуумной обработкой крупногабаритных установок. В данной работе представлен эффективный протокол локализованной вакуумной агроинфильтрации, адаптированный для крупнокалиберных растений. Для оценки эффективности предложенного метода мы протестировали его применение на растениях какао – тропическом виде растений, невосприимчивом к генетической трансформации. Наш протокол позволял применять вакуум до 0,07 МПа, с повторениями, к локализованной надземной части листьев какао, что позволяло форсировать инфильтрацию Agrobacterium в межклеточные пространства прикрепленных листьев. В результате мы добились Agrobacterium-опосредованной транзиентной трансформации planta прикрепленных листьев какао, экспрессирующей для репортерной системы RUBY. Это также первый случай транзиторной трансформации какао, опосредованный агробактериями. Этот протокол позволит применить метод вакуумной агроинфильтрации к другим видам растений с аналогичными размерными ограничениями и откроет дверь для характеристики генов in planta у непокорных древесных крупноразмерных видов.

Introduction

Методы генетической трансформации растений имеют важное значение для проверки биологических функций генов и особенно полезны сегодня, учитывая большое количество неохарактеризованных генов, предсказанных в постгеномнуюэпоху. Эти методы могут быть использованы для получения полностью трансформированных линий или для экспрессии генов на переходной основе. Стабильная трансформация происходит, когда чужеродная ДНК, принятая хозяином, полностью и необратимо интегрируется в геном хозяина, и генетические модификации передаются последующим поколениям. Транзиторная экспрессия, известная как транзиторная трансформация, происходит из нескольких копий Т-ДН....

Protocol

1. Культура Agrobacterium tumefaciens

  1. Размораживание электрокомпетентных клеток штамма Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
  2. Добавьте 1 мл дрожжевого солода (YM; Таблица 1) бульон в культуральную пробирку размером 17 мм х 100 мм. Сохраните эту пробирку на потом и храните пр?.......

Representative Results

Данный протокол представляет собой эффективный метод агроинфильтрации для крупноплодных древесных растений. С помощью этого протокола мы смогли достичь вакуумного давления -0,07 МПа, что привело к эффективной, локализованной инфильтрации листьев какао. На рисунке 4 пок?.......

Discussion

В этой работе мы представили эффективный, недорогой протокол агроинфильтрации для переходной трансформации древесных растений in planta на примере растений какао. Учитывая хорошо известное ограничение, которое кутикула листьев представляет для трансформации тканей растений, мы сос.......

Disclosures

Авторы не могут заявить о конфликте интересов.

Acknowledgements

Мы благодарим Lic. Хесусу Фуэнтесу Гонсалесу и Нестору Ивану Роблесу Оливаресу за помощь в съемках видеоматериала. Мы выражаем признательность доктору Антонии Гутьеррес Мора (Antonia Gutierrez Mora) из CIATEJ (растения какао Theobroma ). Мы также благодарим CIATEJ и Laboratorio Nacional PlanTECC, Мексика, за поддержку объекта. H.E.H.D. (CVU: 1135375) проводил магистерские исследования при финансовой поддержке Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT). R.U.L. выражает благодарность за поддержку со стороны Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) и Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Халиск....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35S:RUBY plasmidAddgene160908http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvetteThermo Fisher Scientific FB101Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
DesiccatorBel-Art SP SCIENCEWARWEF42400-2121
Freeze dryerLABCONCO700402040
K2HPO4Sigma AldrichP8281-500GFor YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent AgrobacteriumIntact Genomics USA1285-12https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
MannitolSigma Aldrich63560-250G-FFor YM medium add 10 g/L
MESSigma AldrichPHG0003(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2Sigma AldrichM8266For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20Sigma Aldrich63138-1KGFor YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation ApparatusBiorad 165-2100
NaClKaral60552For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher Scientific 13-400-518
President Silicone Impression materialCOLTENE60019938
Rifampicin Gold-BioR-120-1(100 mg/mL)
Silicone Impression material gunAndentTBT06
SpectinomycinGold-BioS-140-SL10(100 mg/mL)
StreptomycinGold-BioS-150-SL10(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from caseinSigma Aldrich95039-1KG-FFor LB medium add 10 g/L
Yeast extractMCD LAB9031For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L

References

  1. Yang, J., Jia, M., Guo, J., Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , (2019).
  2. Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved