A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Здесь мы представляем первый протокол локализованной вакуумной инфильтрации для исследований in vivo генетической трансформации крупномерных растений. Используя эту методологию, мы впервые добились Agrobacterium-опосредованной в planta транзиторной трансформации какао.
Переходная трансформация растений является быстрой и экономичной альтернативой генетической трансформации растений. Большинство протоколов трансформации in planta основаны на использовании трансформации, опосредованной агробактериями. Тем не менее, используемые в настоящее время протоколы стандартизированы для малогабаритных установок из-за физических и экономических ограничений, связанных с вакуумной обработкой крупногабаритных установок. В данной работе представлен эффективный протокол локализованной вакуумной агроинфильтрации, адаптированный для крупнокалиберных растений. Для оценки эффективности предложенного метода мы протестировали его применение на растениях какао – тропическом виде растений, невосприимчивом к генетической трансформации. Наш протокол позволял применять вакуум до 0,07 МПа, с повторениями, к локализованной надземной части листьев какао, что позволяло форсировать инфильтрацию Agrobacterium в межклеточные пространства прикрепленных листьев. В результате мы добились Agrobacterium-опосредованной транзиентной трансформации planta прикрепленных листьев какао, экспрессирующей для репортерной системы RUBY. Это также первый случай транзиторной трансформации какао, опосредованный агробактериями. Этот протокол позволит применить метод вакуумной агроинфильтрации к другим видам растений с аналогичными размерными ограничениями и откроет дверь для характеристики генов in planta у непокорных древесных крупноразмерных видов.
Методы генетической трансформации растений имеют важное значение для проверки биологических функций генов и особенно полезны сегодня, учитывая большое количество неохарактеризованных генов, предсказанных в постгеномнуюэпоху. Эти методы могут быть использованы для получения полностью трансформированных линий или для экспрессии генов на переходной основе. Стабильная трансформация происходит, когда чужеродная ДНК, принятая хозяином, полностью и необратимо интегрируется в геном хозяина, и генетические модификации передаются последующим поколениям. Транзиторная экспрессия, известная как транзиторная трансформация, происходит из нескольких копий Т-ДН....
1. Культура Agrobacterium tumefaciens
Данный протокол представляет собой эффективный метод агроинфильтрации для крупноплодных древесных растений. С помощью этого протокола мы смогли достичь вакуумного давления -0,07 МПа, что привело к эффективной, локализованной инфильтрации листьев какао. На рисунке 4 пок?.......
В этой работе мы представили эффективный, недорогой протокол агроинфильтрации для переходной трансформации древесных растений in planta на примере растений какао. Учитывая хорошо известное ограничение, которое кутикула листьев представляет для трансформации тканей растений, мы сос.......
Мы благодарим Lic. Хесусу Фуэнтесу Гонсалесу и Нестору Ивану Роблесу Оливаресу за помощь в съемках видеоматериала. Мы выражаем признательность доктору Антонии Гутьеррес Мора (Antonia Gutierrez Mora) из CIATEJ (растения какао Theobroma ). Мы также благодарим CIATEJ и Laboratorio Nacional PlanTECC, Мексика, за поддержку объекта. H.E.H.D. (CVU: 1135375) проводил магистерские исследования при финансовой поддержке Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT). R.U.L. выражает благодарность за поддержку со стороны Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) и Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Халиск....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved