Modelagem de cirurgia de catarata em camundongos

Summary

Este método modela a cirurgia de catarata in vivo , removendo as células da fibra do cristalino de camundongos adultos e deixando para trás a bolsa capsular com células epiteliais do cristalino (LECs) anexadas. A resposta à lesão é então avaliada em vários momentos após a cirurgia usando critérios moleculares e morfológicos.

Abstract

A cirurgia de catarata (CS) é um tratamento eficaz para a catarata, uma das principais causas de deficiência visual em todo o mundo. No entanto, a SC leva à inflamação ocular e, a longo prazo, pode resultar em opacificação capsular posterior (PCO) e/ou luxação do cristalino impulsionada pelo crescimento excessivo pós-cirúrgico de células epiteliais do cristalino (LECs) e sua conversão em miofibroblastos e/ou células de fibra aberrantes. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais a CS resulta em inflamação e PCO ainda são obscuros porque a maioria dos modelos in vitro não recapitula a resposta de cicatrização de feridas de LECs vistos in vivo, enquanto modelos animais tradicionais de cirurgia de catarata, como coelhos, não permitem a manipulação genética da expressão gênica para testar mecanismos. Recentemente, nosso laboratório e outros usaram com sucesso camundongos geneticamente modificados para estudar os mecanismos moleculares que impulsionam a indução de sinalização pró-inflamatória e transição epitelial para mesenquimal do LEC, levando a uma nova visão sobre a patogênese da PCO. Aqui, relatamos o protocolo estabelecido para modelagem de cirurgia de catarata em camundongos, que permite um perfil transcricional robusto da resposta de LECs à remoção de células de fibra de cristalino via RNAseq, a avaliação da expressão de proteínas por imunofluorescência semiquantitativa e o uso de ferramentas genéticas modernas de camundongos para testar a função de genes que supostamente participam da patogênese de sequelas agudas como inflamação, bem como a conversão posterior de LECs em miofibroblastos e/ou células de fibra de lente aberrantes.

Introduction

A lente é um tecido transparente e altamente organizado que refrata a luz para produzir uma imagem claramente focada na retina ^1,2,3. Este órgão especializado é cercado por uma membrana basal ininterrupta (a cápsula), que isola o cristalino de outras partes do olho. A superfície anterior interna da cápsula ancora uma monocamada de células epiteliais do cristalino (LECs), que então se diferenciam no equador do cristalino em células de fibra do cristalino, que compreendem a grande maioria do cristalino³. A catarata ocorr....

Protocol

O protocolo a seguir foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Delaware sob o protocolo #1039-2021-1. Em conformidade com a Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research²⁴, todas as cirurgias de sobrevivência ocular só podem ser realizadas em um olho. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre reagentes e instrumento.......

Discussion

Esta técnica cirúrgica requer manuseio avançado de camundongos e habilidades microcirúrgicas que exigem prática para se desenvolver. O mais difícil de dominar é a colocação de suturas finas na córnea para fechar a ferida. Suponha que o experimentador seja um novato total em sutura. Nesse caso, recomenda-se primeiro praticar o uso de barbante e pano e, em seguida, passar a praticar o uso de suturas de grande diâmetro em frutas pequenas para dominar os movimentos manuais necess?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Erythryomycin opthalmic ointment USP	Baush Lomb	24208-910-55
1% Atropine sulfate ophthalmic solution	Amneal	60219-1748-2
1% Tropicamide opthalmic solution USP	Akorn	17478-102-12
10-0 Nylon suture	Ethicon	7707G
2.5% Phenylephrine hydrochloride ophtahlmic solution USP	Akorn	17478-200-12
26 G 1/2 Needles - straight	BD PrecisionGlide	5111
27 G 45° bent dispensing tip 1"	Harfington
Balanced saline solution	Phoenix	57319-555-06
Bupranorphine (0.1 mg/kg)	APP Pharmaceticals	401730D
Chlorhexidine solution
Needle holder 2-110	Duckworth & Kent	2-110-3E
Noyes scissors, straight	Fine Science Tools	12060-02
SMZ800 Nikon model microscope	Nikon
Sterile disposable scalpel No.11	Feather	2975#11
Tweezers #5 Dumont	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Xylazine/Ketamine/Acepromazine (35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg) solution	APP Pharmaceticals	401730D