A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים
In This Article
Summary
אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.
Abstract
נויטרופילים הם תאים משושלת מיאלואידית המהווים חלק חיוני של מערכת החיסון המולדת. העשור האחרון חשף תפקידי מפתח נוספים שנויטרופילים ממלאים בפתוגנזה של סרטן, מחלות אוטואימוניות ומצבים דלקתיים חריפים וכרוניים שונים, בכך שהם תורמים לייזום ולהנצחה של חוסר ויסות חיסוני באמצעות מנגנונים מרובים, כולל היווצרות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs), שהם מבנים חיוניים להגנה אנטי-מיקרוביאלית. מגבלות בטכניקות לכימות היווצרות רשת באופן בלתי מוטה, ניתן לשחזור ויעיל הגבילו את יכולתנו להבין עוד יותר את תפקידם של נויטרופילים בבריאות ובמחלות. אנו מתארים שיטה אוטומטית, בזמן אמת ובתפוקה גבוהה לכימות נויטרופילים העוברים היווצרות רשת באמצעות פלטפורמת הדמיה של תאים חיים בשילוב עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה, תוך שימוש בשני צבעי דנ"א שונים כדי לדמיין דנ"א תוך-תאי וחוץ-תאי. מתודולוגיה זו מסוגלת לסייע בהערכת הפיזיולוגיה של הנויטרופילים ולבדוק מולקולות שיכולות להתמקד בהיווצרות רשת.
Introduction
מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) הן מבני כרומטין דמויי רשת שנפלטים מנויטרופילים בתגובה לגירויים דלקתיים שונים. NETs מורכבים מדנ"א, היסטונים וחלבונים/פפטידים אנטי-מיקרוביאליים שונים, אשר לוכדים והורגים פתוגנים זיהומיים ומעוררים תגובות דלקתיות1.
בעוד NETs מועילים להגנה על המארח מפני פתוגנים, הם צברו תשומת לב כמניע פוטנציאלי של מחלות אוטואימוניות שונות2, פקקת3, מחלות מטבוליות4, וצמיחה גרורתית של סרטן5. ככזה, עיכוב של היווצרות NET הוא אופציה טיפולית פוטנציאלית עבור מחלות אלה. עם זאת, למרות כמה מולקולות מכוונות NETs מבטיחות....
Protocol
נויטרופילים מנבדקים אנושיים בריאים התקבלו לאחר שניתנה הסכמה מדעת במסגרת פרוטוקול מאושר של מועצת הביקורת המוסדית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של NIH.
1. צביעת הנויטרופילים והכנת צלחת הבדיקה
- יש ליטול דם ה.......
Representative Results
שיטה זו מספקת ניגודיות פאזה, תמונות פלואורסצנטיות אדומות (צבע חדיר לממברנה) וירוק פלואורסצנטי (צבע אטום לממברנה) שצולמו בכל נקודת זמן. יחד עם תהליך יצירת NET, שינויים מורפולוגיים נצפים בניגודיות פאזה ובתמונות פלואורסצנטיות אדומות, וברגע שהקרום נפרץ, ניתן לראות פלואורסצנטיות ירוקה (
Discussion
לשיטות הנוכחיות לכימות NETs ex vivo יש מספר חסרונות המגבילים את יכולתנו לחקור נויטרופילים, NETs ומטרות טיפוליות פוטנציאליות באופן בלתי משוחד ובתפוקה גבוהה10,14. לדוגמה, ספירה ישירה של תאים יוצרי NET לאחר צביעה אימונופלואורסצנטית, הנחשבת לתקן הזהב לכימות NETs, היא .......
Acknowledgements
אנו מודים למדור דימות אור במשרד המדע והטכנולוגיה במכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר Intramural של המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות (ZIA AR041199).
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases.....
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved