בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה

Summary

בדיקות כימיות מהירות ומדויקות לסינון מעכבים ספציפיים הן כלי חשוב בארסנל פיתוח התרופות. כאן, אנו מציגים בדיקה כימית מדרגית של קליק אצטיל-קליק כדי למדוד את העיכוב של פעילות אצטילציה HAT1.

Abstract

HAT1, הידוע גם בשם היסטון אצטילטרנספראז 1, ממלא תפקיד מכריע בסינתזה של כרומטין על ידי ייצוב ואצטילציה של H4 מתהווה לפני הרכבת נוקלאוזומים. הוא נדרש לצמיחת הגידול במערכות שונות, מה שהופך אותו למטרה פוטנציאלית לטיפול בסרטן. כדי להקל על זיהוי תרכובות שיכולות לעכב פעילות אנזימטית של HAT1, פיתחנו בדיקת אצטיל-קליק לסינון מהיר. בבדיקה פשוטה זו, אנו משתמשים ב- HAT1/Rbap46 רקומביננטי, אשר מטוהר מתאים אנושיים פעילים. השיטה משתמשת באנלוגי אצטיל-CoA 4-pentynoyl-CoA (4P) בגישה כימיית קליק. זה כרוך בהעברה אנזימטית של ידית אלקין דרך תגובת אצילציה תלוית HAT1 לפפטיד H4 N-terminal ביוטינילציה. לאחר מכן הפפטיד שנלכד משותק על לוחות נויטרווידין, ולאחר מכן מתפקד כימיית קליק עם ביוטין-אזיד. לאחר מכן, גיוס סטרפטווידין-פרוקסידאז משמש לחמצון אדום אמפלקס, וכתוצאה מכך פלט פלואורסצנטי כמותי. על ידי החדרת מעכבים כימיים במהלך תגובת האצילציה, אנו יכולים לכמת עיכוב אנזימטי בהתבסס על הפחתה של האות הפלואורסצנטי. חשוב לציין, תגובה זו ניתנת להרחבה, ומאפשרת סינון בתפוקה גבוהה של מעכבים פוטנציאליים לפעילות אנזימטית HAT1.

Introduction

בין האצטילטרנספראזות האיקריוטיות הרבות, HAT1 היה ההיסטון אצטילטרנספראז הראשוני שבודד ^1,2,3. מחקרים מאוחרים יותר ביססו היטב את תפקידו המרכזי בשכפול הכרומטין, במיוחד בסינתזה של נוקלאוזומים חדשים במהלך שלב^{S 4}. מאמצי המחקר שלנו הובילו להכרה כי HAT1 מגורה מאוד על ידי טיפול בגורם גדילה אפידרמלי (EGF) בתאי חלב⁵. יתר על כן, התברר כי HAT1 נדרש להתרבות תאים מהירה והיווצרות גידולים in vivo 6,7,8,9. הנתונ....

Protocol

1. שיטה 1: ייצור וטיהור קומפלקס רקומביננטי HAT1/Rbap46

1. הפשרה, שחזור והרחבה של תאי HEK293f
   1. הפשירו 1-10 מיליון תאי יונקים HEK293f²⁶ לתוך 30 מ"ל בסגנון חופשי 293 מדיה בבקבוק 100 מ"ל. יש לדגור ב-8% CO₂ ב-37°C תוך כדי סיבוב ב-60 סל"ד.
   2. למחרת, ספרו ובדקו את כדאיות התא, ולאחר מכן התאימו.......

Discussion

בעשור האחרון, כימיית הקליק הפכה לבולטת²⁰, ואפשרה תכנון מדויק של מבנים כימיים אינטראקציה. בהקשר זה, קשרים קוולנטיים ביו-אורתוגונליים שונים²¹ התגלו כאפשרויות מבטיחות ליצירת קומפלקסים בסביבתם הטבעית. כימיית קליקים משתמשת בזוגות של קבוצות פונקציונליות המציגות תגובו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher