Un test chimico acetil-click per misurare l'acetiltransferasi istonica 1

Summary

Saggi chimici rapidi e accurati per lo screening di inibitori specifici sono uno strumento importante nell'arsenale di sviluppo dei farmaci. Qui, presentiamo un saggio chimico scalabile acetil-click per misurare l'inibizione dell'attività di acetilazione di HAT1.

Abstract

HAT1, noto anche come istone acetiltransferasi 1, svolge un ruolo cruciale nella sintesi della cromatina stabilizzando e acetilando l'H4 nascente prima dell'assemblaggio del nucleosoma. È necessario per la crescita del tumore in vari sistemi, il che lo rende un potenziale bersaglio per il trattamento del cancro. Per facilitare l'identificazione di composti in grado di inibire l'attività enzimatica di HAT1, abbiamo ideato un saggio acetil-click per uno screening rapido. In questo semplice saggio, impieghiamo HAT1/Rbap46 ricombinante, che viene purificato da cellule umane attivate. Il metodo utilizza l'analogo dell'acetil-CoA 4-pentinoil-CoA (4P) in un approccio click-chemistry. Ciò comporta il trasferimento enzimatico di un manico alchino attraverso una reazione di acilazione HAT1-dipendente a un peptide N-terminale H4 biotinilato. Il peptide catturato viene quindi immobilizzato su piastre di neutravidina, seguita da una funzionalizzazione click-chemistry con biotina-azide. Successivamente, il reclutamento della streptavidina-perossidasi viene impiegato per ossidare il rosso amplex, con conseguente emissione fluorescente quantitativa. Introducendo inibitori chimici durante la reazione di acilazione, possiamo quantificare l'inibizione enzimatica in base ad una riduzione del segnale di fluorescenza. È importante sottolineare che questa reazione è scalabile, consentendo lo screening ad alto rendimento di potenziali inibitori per l'attività enzimatica di HAT1.

Introduction

Tra le numerose acetiltransferasi eucariotiche, HAT1 è stata la prima istone acetiltransferasi ad essere isolata ^1,2,3. Indagini successive hanno stabilito il suo ruolo fondamentale nella replicazione della cromatina, in particolare nella sintesi di nuovi nucleosomi durante la fase^{S 4}. I nostri sforzi di ricerca hanno portato al riconoscimento che HAT1 è altamente stimolato dal trattamento con fattore di crescita epidermico (EGF) nelle cellule mammarie⁵. Inoltre, è venuto alla luce che HAT1 è necessario per una rapida proliferaz....

Protocol

1. Metodo 1: produzione e purificazione del complesso ricombinante HAT1/Rbap46

1. Scongelamento, recupero ed espansione delle cellule HEK293f
   1. Scongelare 1-10 milioni di cellule di mammifero HEK293f²⁶ in terreni di espressione freestyle 293 da 30 mL in un pallone da 100 mL. Incubare in CO₂ all'8% a 37 °C ruotando a 60 giri/min.
   2. Il giorno successivo, contare e controllare la vitalità delle celle, quindi regolare la velocità di rotazione a 120 g.......

Discussion

Nell'ultimo decennio, la click chemistry è diventata importante²⁰, consentendo la progettazione precisa di strutture chimiche interagenti. In questo contesto, varie connessioni covalenti bioortogonali²¹ sono emerse come opzioni promettenti per la formazione di complessi nel loro ambiente naturale. La chimica dei clic impiega coppie di gruppi funzionali che mostrano reazioni rapide e selettive, comunemente note come "reazioni di clic". Queste reazioni si verificano in modo .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher