Editing del genoma CRISPR-Cas9 di embrioni di ratto utilizzando il virus adeno-associato (AAV) e l'elettroporazione di embrioni a 2 cellule

La tecnologia di editing del genoma è ampiamente utilizzata per produrre animali geneticamente modificati, compresi i ratti. L'iniezione citoplasmatica o pronucleare di modelli di riparazione del DNA e reagenti CRISPR-Cas è il metodo di somministrazione più comune negli embrioni. Tuttavia, questo tipo di micromanipolazione richiede l'accesso ad attrezzature specializzate, è laborioso e richiede un certo livello di abilità tecnica. Inoltre, le tecniche di microiniezione spesso comportano una minore sopravvivenza dell'embrione a causa dello stress meccanico sull'embrione. In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo ottimizzato per fornire modelli di riparazione del DNA di grandi dimensioni da lavorare in combinazione con l'editing del genoma CRISPR-Cas9 senza la necessità di microiniezioni. Questo protocollo combina la somministrazione di DNA mediata da AAV di modelli di donatori di DNA a singolo filamento con la somministrazione della ribonucleoproteina CRISPR-Cas9 (RNP) mediante elettroporazione per modificare gli embrioni a 2 cellule. Utilizzando questa nuova strategia, abbiamo prodotto con successo modelli mirati di ratto knock-in con inserzione di sequenze di DNA di dimensioni comprese tra 1,2 e 3,0 kb con efficienze comprese tra il 42% e il 90%.