CRISPR-Cas9 genomredigering av rotteembryoer ved bruk av adenoassosiert virus (AAV) og 2-celleembryoelektroporering

Genomredigeringsteknologi er mye brukt til å produsere genetisk modifiserte dyr, inkludert rotter. Cytoplasmatisk eller pronukleær injeksjon av DNA-reparasjonsmaler og CRISPR-Cas-reagenser er den vanligste leveringsmetoden i embryoer. Imidlertid krever denne typen mikromanipulasjon tilgang til spesialutstyr, er arbeidskrevende og krever et visst nivå av teknisk ferdighet. Videre resulterer mikroinjeksjonsteknikker ofte i lavere embryooverlevelse på grunn av den mekaniske belastningen på embryoet. I denne protokollen utviklet vi en optimalisert metode for å levere store DNA-reparasjonsmaler for å fungere sammen med CRISPR-Cas9-genomredigering uten behov for mikroinjeksjon. Denne protokollen kombinerer AAV-mediert DNA-levering av enkeltstrengede DNA-donormaler sammen med levering av CRISPR-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) ved elektroporering for å modifisere 2-celleembryoer. Ved hjelp av denne nye strategien har vi vellykket produsert målrettede knock-in rottemodeller som bærer innsetting av DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse med effektivitet mellom 42% og 90%.