Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В данной статье описан протокол распространения циркулирующих в спинномозговой жидкости опухолевых клеток (ЦОК) спинномозговой жидкости, собранных у пациентов с меланомально-ассоциированной лептоменингеальной болезнью (М-ЛМД) для разработки доклинических моделей для изучения М-ЛМД.

Abstract

Меланома-ассоциированная лептоменингеальная болезнь (М-ЛМД) возникает, когда циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) попадают в спинномозговую жидкость (СМЖ) и колонизируют мозговые оболочки, мембранные слои, которые защищают головной и спинной мозг. После установления прогноз для пациентов с М-ЛМД мрачный, общая выживаемость составляет от нескольких недель до месяцев. В первую очередь это связано с недостаточным пониманием болезни и, как следствие, наличием эффективных вариантов лечения. Определение биологии, лежащей в основе М-ЛМД, значительно улучшит способность адаптировать доступные методы лечения М-ЛМД или разработать новые ингибиторы для этого универсально смертельного заболевания. Однако основным препятствием является получение достаточного количества ЦОК из СМЖ пациента (ЦОК-СМЖ) для проведения доклинических экспериментов, таких как молекулярная характеристика, функциональный анализ и исследования эффективности in vivo . Культивирование ЦОК-СМЖ ex vivo также оказалось сложной задачей. Для решения этой проблемы был разработан новый протокол культивирования полученных от пациента M-LMD CSF-CTC EX VIVO и in vivo . Включение кондиционированных сред, продуцируемых менингеальными клетками человека (ММК), имеет решающее значение для процедуры. Анализ цитокиновых матриц показывает, что факторы, продуцируемые ГМК, такие как инсулиноподобные белки, связывающие фактор роста (IGFBP) и фактор роста эндотелия сосудов-А (VEGF-A), играют важную роль в обеспечении выживаемости ликвора-CTC ex vivo. В данной работе продемонстрирована полезность выделенных у пациента линий СМЖ-ЦТК при определении эффективности ингибиторов, нацеленных на сигнальные пути инсулиноподобного фактора роста (ИФР) и митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK). Кроме того, показана способность интратекально инокулировать эти клетки in vivo для создания мышиных моделей M-LMD, которые могут быть использованы для доклинических испытаний одобренных или новых методов лечения. Эти инструменты могут помочь разгадать основную биологию, определяющую образование ликвора-КТК в мозговых оболочках, и определить новые методы лечения для снижения заболеваемости и смертности, связанных с М-ЛМД.

Introduction

Лептоменингеальная болезнь (ЛМД) возникает, когда циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) диссессируются в спинномозговую жидкость (СМЖ) и образуются в мозговых оболочках, оболочке, окружающих головной и спинной мозг 1,2. ЛМД может возникать при нескольких видах рака, но особенно распространен при меланоме. На поздних стадиях меланомы примерно у 5% пациентов развивается меланома-ассоциированный M-LMD 2,3. Несмотря на относительно низкие показатели по сравнению с другими местами метастазирования, последствия М-ЛМД являются разрушительными, общая выживаемость составляет от нескольких недель до нескольких месяцев, и они вносят значительный вклад в заболеваемость пациентов 1,3,4. В первую очередь это связано с нехваткой эффективных вариантов лечения в сочетании с серьезными пробелами в наших знаниях о том, как лептоменинги колонизируются клетками меланомы2. Таким образом, понимание биологии M-LMD будет способствовать разработке новых методов лечения для улучшения клинических результатов.

Недавние исследования показали, как ЦОК колонизируют уникальное микроокружение спинномозговой жидкости. Например, комплемент С3 способствует инвазии опухолевых клеток в спинномозговую жидкость через сосудистое сплетение, сложную сеть кровеносных сосудов в каждом желудочкемозга. Кроме того, в ответ на дефицит микронутриентов в спинномозговой жидкости, ЦОК могут повышать уровень липокалина-2, белка, поглощающего железо, и его рецепторные SLC22A17 дляповышения выживаемости. Используя анализ ликвора на основе омики , наша группа также обнаружила, что спинномозговая жидкость обогащена белками, которые регулируют передачу сигналов инсулиноподобного фактора роста (ИФР), а также врожденный иммунитет3. В совокупности эти данные подчеркивают ценность ЦОК-СМЖ из жидкостных биопсий для изучения М-ЛМД.

Несмотря на то, что ЦОК в спинномозговой жидкости иногда можно идентифицировать путем взятия образцов спинномозговой жидкости пациента с помощью люмбальной пункции, резервуара Оммайя или быстрого вскрытия, основным ограничением является получение достаточного количества этих редких и хрупких клеток 1,7. Например, при использовании метода подсчета КТК можно идентифицировать только от нескольких сотен до нескольких тысяч опухолевых клеток на один образец7 ликвора пациента, что затрудняет проведение молекулярного и функционального анализа in vitro или in vivo. Несмотря на то, что были сообщения об успешном кратковременном выращивании ЦОК ex vivo из периферической крови (т.е. ЦОК рака молочной железы)8,9,10, эти клетки обычно растут только в краткосрочной перспективе, и не было зарегистрировано ни одного случая возможности выращивания ЦОК меланомы в спинномозговой жидкости. Следовательно, поиск способов размножения меланомы СМФ-ЦОК, или ЦОК в целом, будет очень полезен для изучения биологии M-LMD 7,11.

Впервые описана новая методика размножения ЦОК в спинномозговой жидкости от пациентов с М-ЛМД ex vivo. В этом отчете был разработан подробный протокол, который позволяет проводить культивирование и расширение ЦОК в спинномозговой жидкости у пациентов с М-ЛМД. Поскольку мозговые оболочки секретируют различные факторы роста, такие как FGF, IGF, VEGF-A и IGFBPs, которые поддерживают рост окружающей их среды 12,13,14,15,16, было обосновано, что ЦОК-СМЖ могут требовать этих компонентов для роста в условиях ex vivo. Таким образом, в этом протоколе используются кондиционированные среды, полученные путем культивирования менингеальных клеток человека (HMCs-) in vitro. Для инокуляции in vivo клетки, полученные от пациента, инокулируются мышам с иммунодефицитом для получения линий ЦОК-СМК (PD-CSF-CTC) от пациента. Доступность М-ЛМД, полученных от пациентов, будет способствовать клеточным, молекулярным и функциональным анализам для изучения М-ЛМД и предложит новые стратегии лечения этого смертельного заболевания.

Protocol

Сбор образцов обезличенных ликворов пациентов был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) Университета Южной Флориды (MCC 50103, 50172 и 19332). Пациенты с М-ЛМД могут быть диагностированы несколькими способами, включая положительную цитологию ликвора, характерную магнитно-резонансную томографию (МРТ) головного мозга и/или позвоночника или комбинацию клинических данных с наводящими на размышления результатами МРТ. Спинномозговая жидкость у этих пациентов с М-ЛМД была собрана в обычном порядке в рамках стандартного клинического лечения. Никакая процедура не проводится без клинических показаний. От пациентов было получено информированное согласие на сбор образцов и их использование в исследованиях и публикациях. Создание моделей in vivo murine-LMD было одобрено Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Южной Флориды (IACUC# IS00010398). Общая схема этого протокола представлена на рисунке 1. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка сред, кондиционированных HMC

  1. Покройте колбу T175 поли-л-лизином в концентрации 2 мкг/см2.
  2. Поместите колбу в инкубатор с температурой 37 °C на 1 час.
  3. Аспирируйте раствор поли-l-лизина с помощью стерильной серологической пипетки. Он не требует промывки колбы, и готов к посеву ГМС.
  4. Культивируйте приблизительно 1,0 x 106 ГМК в 30 мл полной менингеальной питательной среды (MenCM), которая содержит 5% фетальной бычьей сыворотки, 1% добавку для роста менингеальных клеток и 100 МЕ/мл раствора антибиотика пенициллин-стрептомицин в колбе. Культивируйте клетки в инкубаторе для клеточных культур в стандартных условиях культивирования тканей при 37 °C и 5%CO2.
  5. Меняйте носители каждые 3 дня.
  6. Когда клетки достигают примерно 75–80% конфлюенции, соберите и сохраните культивируемую среду HMC в конической пробирке объемом 50 мл.
  7. Разделите HMC на новые колбы T175 и свежие полные MenCM, если требуется больше питательных сред HMC.
  8. К питательной среде HMC добавьте соотношение полного MenCM 1:1.
  9. Добавьте 20 нг/мл фактора роста фибробластов (FGF) и 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), которые станут HMC-кондиционированной средой для СМЖ-ЦОК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавлять свежие FGF и EGF, когда CTC готовы к культивированию.
  10. Храните среды, кондиционированные HMC, в аликвотах объемом 50 мл при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется хранить среды, кондиционированные HMC, в аликвотах при температуре 4 °C, но не более 4 недель.

2. Сбор СМЖ и обработка образцов

  1. Предварительно охладите центрифугу, установив ее на 4 °C.
  2. После забора у пациента немедленно поместите образец спинномозговой жидкости в коническую пробирку объемом 15 мл на лед, чтобы он оставался прохладным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наш протокол, одобренный IRB, позволяет брать 7,5 мл спинномозговой жидкости у пациента, давшего согласие.
  3. Центрифугируйте ликвор при 257 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  4. Извлеките, сохраните и сделайте аликвоты надосадочной жидкости для спинномозговой жидкости, не потревожив клеточную гранулу на дне. Аликвоты надосадочной жидкости могут храниться в замороженном виде при температуре -80 °C, если это необходимо для дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна невооруженным глазом; следовательно, рекомендуется оставлять ~40-50 μL на дне пробирки.
  5. В ту же пробирку добавьте 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) для ресуспендирования и промывания клеток и повторите отжим при 257 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Выполните лизис эритроцитов (RBC), если образец содержит загрязнение крови. Однако имейте в виду, что некоторые клетки могут быть потеряны во время процесса, в том числе ЦОК. ЦОК могут размножаться без процедуры лизиса эритроцитов.
  6. Удалите и выбросьте PBS, не потревожив гранулу клетки, и оставьте ~50 μL на дне.
  7. Выполните подсчет клеток для определения жизнеспособности клеток. Исходя из этого, есть два варианта продолжения выращивания ЦОК-спинномозговой жидкости: культивирование in vitro (шаг 3) или попытка расширения ксенотрансплантата, полученного от пациента in vivo (шаг 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ЦОК-СМЖ должны быть культивированы в более позднее время, криоконсервируйте клетки в замораживающей среде для клеточной культуры до тех пор, пока они не будут готовы к размножению. Среда для замораживания клеточных культур может быть изготовлена с использованием 90% FBS + 10% ДМСО. Если имеется избыток СМЖ (т.е. более одного сбора СМЖ у пациентов или сбор СМЖ при вскрытии), ЦОК можно оценить, предоставив образец для анализа ЦОК17 или иммунофлуоресцентного (ИФ) окрашивания на маркер меланомы (т.е. анти-MLANA), что может дать представление о количестве и жизнеспособности ЦОК. Клетки не могут быть восстановлены после проведения этих экспериментов. Поэтому не рекомендуется при отсутствии резервных образцов спинномозговой жидкости от пациента.

3. Культивирование in vitro и экспансия ЦОК-СМЖ

  1. Ресуспендирование ЦОК-СМК в средах, кондиционированных HMC. Если ЦОК-СМЖ криоконсервированы, разморозьте клетки, открутите их и аккуратно промойте PBS.
  2. Разделите все ячейки на тройные лунки в 96-луночном планшете объемом 150 мкл на лунку. Только жизнеспособные клетки будут слегка прилипать к поверхности за ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ЦОК-СМЖ может сильно варьироваться в зависимости от образца пациента (Таблица 1). Для пациентов с низким количеством ЦОК в качестве отправной точки для культивирования используется 96-луночный планшет, и вся гранула покрывается без подсчета из-за боязни потери ЦОК. Однако, если имеется большее количество ликвора (т.е. полученного в результате вскрытия), можно подсчитать клетки. Не все опухолевые клетки могут расти ex vivo; Некоторые из них будут медленно расширяться в течение нескольких проходов, прежде чем станут статичными. В настоящее время шансы на успех выращивания меланомы CSF-CTC ex vivo составляют примерно 60%7.
  3. Каждые 3 дня доливайте, добавляя свежий фильтрующий материал, скондиционированный HMC, или аккуратно удаляйте фильтрующий материал, поместив наконечник пипетки сбоку лунки, оставляя немного жидкости, не нарушая дно лунки, а затем заменяйте его свежим фильтрующим материалом, кондиционированным HMC.
  4. Когда ex vivo ЦОК-СМК расширяются и становятся на 90% конфлюентными, трипсинизируются и переносят всю лунку в новую лунку в 24-луночном планшете. Когда лунка в 24-луночном стакане сливается, переведите ее на 12-луночный планшет, затем на 6-луночный планшет и так далее.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После трипсинизации рассмотрите возможность криоконсервирования небольшого подмножества ЦОК в среде для замораживания клеточных культур (10% ДМСО + 90% FBS) перед нанесением покрытия в качестве резервного.
  5. Продолжайте культивирование ЦОК. Некоторые клетки могут размножаться в течение короткого периода времени и в конечном итоге становятся статичными. Однако один или несколько клонов могут трансформироваться и расширяться экспоненциально (рис. 2A). Выберите эти клоны, которые станут культурами CSF-CTC IN VITRO, ПОЛУЧЕННЫМИ ОТ ПАЦИЕНТА (PD-CSF-CTCs).
    Примечание: Если эти клоны становятся переполненными или кластеризуются, трипсинизируйте и перепланируйте клетки в планшет для свежей культуры тканей.

4. Инокуляция ЦОК-ликвора in vivo для получения ксенотрансплантата, полученного из клеточной линии (CDX) или модели ксенотрансплантата, полученного от пациента (PDX)

Примечание: Модель PDX включает в себя приживление раковых клеток непосредственно от больного раком (без культивирования ex vivo), в то время как модель CDX использует линии раковых клеток или, в данном случае, ЦОК, которые были размножены и увековечены.

  1. Используйте самок мышей с иммунодефицитом NOD SCID gamma (NSG) в возрасте 6-8 недель для инокуляции CSF-CTCs. ГЯП используются потому, что они обладают тяжелым иммунодефицитом и очень восприимчивы к приживлению опухолевых клеток человека19. Из-за их иммунодефицита эти мыши должны содержаться в строго контролируемой гигиенической среде и должны содержаться изолированно от других линий мышей. Способ получения мыши-ЛМД был подробно описан в другом месте20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: клетки ex vivo (ЦОК в спинномозговой жидкости пациентов, которые были обработаны только на этапе 2 без культивирования) используются для создания модели PDX; физическое наблюдение за животным и МРТ головного мозга необходимы для определения прогрессирования ЛМД. С другой стороны, с помощью модели CDX, использующей in vitro, PD-CSF-CTC могут быть помечены люциферазным репортером, а статус ЛМД может быть оценен с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI). Система мечения клеток, используемая в данном отчете, представляет собой репортер NanoLuc (NL), в котором в качестве субстрата используется фуримазин, который, как было показано, увеличивает чувствительность пропорционально росту опухоли21. Интерференции роста клеток ЦОК (in vitro или in vivo) экспрессией NL не наблюдалось.
  2. Проверьте признаки прогрессирования ЛМД с помощью таких методов: физическое наблюдение: потеря веса, наклон головы и сгорбленная спина. МРТ: увеличение желудочков и признаки гидроцефалии (рисунок 2В). BLI: положительные биолюминесцентные сигналы в области ЦНС (рис. 2C).

5. Сбор спинномозговой жидкости у мышей с ЛМД для последующего клонирования

  1. Обезболивайте мышь NSG ЛМД с 4% изофлураном (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) до тех пор, пока у нее не исчезнут признаки корректирующего рефлекса.
  2. Подготовьте мышь, сбрив шерсть по всей брюшной поверхности головы и подготовьте кожу стерильной техникой.
  3. Расположите нос с помощью модифицированного L-образного носового обтекателя стереотаксического аппарата, обеспечив беспрепятственное расположение ноздрей. Закрепите кожу, осторожно потянув ее вперед по брюшным поверхностям обеих ушных раковин с помощью ленты, прикрепив ее к носовому конусу, а затем согнув шею примерно под углом 90° после закрепления. Введите 1,5%-3% изофлуран для поддержания анестезии.
  4. Полностью вытягивая шею и начиная прямо между ушными раковинами, направьте кончики хирургических ножниц вниз через затылочную кость с легким надавливанием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом положении по средней линии заметно легкое углубление, когда кончики ножниц входят в вогнутую область над большой цистерной.
  5. Сделайте небольшой разрез по средней линии размером 5-7 мм чуть выше пальпируемой вогнутости.
  6. Используйте щипцы с тупым наконечником и наконечниками 1-2 мм, чтобы мягко надавить на большую цистерну. Введите наконечники в закрытое положение и откройте их, оказывая давление на твердую мозговую оболочку вниз.
  7. Повторяйте процесс тупого рассечения, как описано в шаге 6, до тех пор, пока твердая мозговая оболочка не станет четко различима, а связанные с ней кровеносные сосуды не станут видны в зоне воздействия.
  8. Держа щипцы открытыми, чтобы втянуть окружающую мускулатуру, введите иглу 27-29 G, прикрепленную к шприцу объемом 1 мл под твердую мозговую оболочку, чтобы визуализировать скос. Убедитесь, что игла проникает прямо за пределы фаски. Постепенно втягивайте поршень шприца.
  9. Соберите как можно больше спинномозговой жидкости (обычно от 15 до 30 мкл) перед эвтаназией мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия осуществляется, в соответствии с институционально утвержденными протоколами, путем воздействия на субъекта возрастающих концентраций сжатого газа CO2 . Например, скорость смещения от 30% до 70% от объема камеры в минуту будет использоваться для предотвращения или уменьшения дискомфорта или стресса. При этом обеспечивается прекращение сердечно-сосудистых и дыхательных движений путем длительного наблюдения на воздухе помещения дольше 10 минут.
  10. Разверните спинномозговую жидкость из шприца в микроцентрифужную пробирку и поместите ее на лед.
  11. Вращайте образец при температуре 257 x g в течение 5 минут при 4 °C и аккуратно удалите жидкость (при необходимости заморозьте образец спинномозговой жидкости мыши при температуре -80 °C для дальнейшего анализа), не повреждая клеточную гранулу.
  12. Добавьте 500 мкл стерильного PBS и промойте клеточную гранулу; Повторяйте вращение при 257 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
  13. Ресуспендируйте клетки в средах, кондиционированных HMC, в 96-луночном планшете.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ЦОК-СМЖ, которые были привиты in vivo и успешно выращены в ЛМД, должны иметь возможность расти как обычные клеточные культуры. Продолжайте расширяться, меняя носители каждые 3 дня. Трипсинизируйте и переносите клетки в более крупный аппарат для культивирования клеток, когда клетки сливаются. Эти клетки станут культурами PD-CSF-CTC IN VIVO. В текущем отчете был отмечен 100% успех модели CDX, и еще предстоит создать PDX M-LMD.

Representative Results

Понимание требований для успешного роста ЦОК-СМЖ ex vivo является постоянной задачей. В связи с этим считается, что обеспечение существенных факторов, имитирующих микросреду СМЖ, имеет ключевое значение22. Менингеальные клетки человека (МЦК) секретируют различные факторы роста в СМЖ, включая FGF-2, EGF, IGFBP2 и IGFBP6, и, как известно, поддерживают рост клеток ЦОК 12,13,14,23,24. Поэтому был проведен анализ цитокинового массива человека на средах, кондиционированных HMC, чтобы определить потенциально важные компоненты, необходимые для выживания CTC. Действительно, несколько факторов роста были активированы в средах, культивируемых с помощью HMC (Рисунок 3A). Например, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), VEGF-A и IGFBP (IGFBP2, 3, 4 и 6).

Клеточные компоненты спинномозговой жидкости пациентов могут состоять из нескольких типов клеток, таких как ЦОК, иммунные клетки и фибробласты. Не-CTC в конечном итоге перестанут пропускать со временем. Как правило, клетки, которые успешно размножаются и остаются в пролиферации, являются раковыми клетками (M-LMD). Валидация растущих клеток в культуре действительно представляет собой клетки M-LMD, что может быть сделано путем обнаружения экспрессии MLANA методом IF и транскриптомного анализа, чтобыло показано ранее.

В качестве доказательства концепции, демонстрирующей потенциальное использование и применение установленных линий PD-CSF-CTC IN VITRO и in vivo, был использован анализ секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq), и в результате было выявлено несколько генов, которые были обогащены и сохранены у некультивируемых пациентов с CSF-CTCs7. Два из них включают рецептор тирозин-протеинкиназы ErbB3 и IGF-1R, которые влияют на прогрессирование меланомы и резистентность к химиотерапии 25,26,27.

Чтобы проверить, играют ли они роль в выживаемости CSF-CTC, был проведен анализ пролиферации кристаллического фиалка на PD-CSF-CTCs, обработанных одобренными FDA препаратами тукатинибом и церитинибом, которые нацелены на ErbB28 и IGF-1R 7,29 соответственно. Антитела к IGFBP2 были включены в качестве положительного контроля, который должен препятствовать росту культур PD-CSF-CTC. Результаты показали, что отсутствие IGFBP2 или IGF-1R было эффективным в снижении пролиферации PD-CSF-CTC (рисунок 3B). Учитывая, что передача сигналов MAPK происходит после IGF-1R, окрашивание живых клеток кальцеином-AM и анализ выживаемости клеток МТТ также были проведены в трех линиях M-LMD PD-CSF-CTC путем обработки их церитинибом или ингибиторами MAPK, дабрафенибом и траметинибом или комбинацией всех трех. Данные показали, что церитиниб значительно снижает жизнеспособность всех трех клеточных линий, в то время как дабрафениб и траметиниб имеют смешанные эффекты (рис. 3C). Результат лечения дебрафенибом и траметинибом был удивительным. Все три линии PD-CSF-CTC были получены от пациентов с M-LMD, которые несли BRAFV600E мутацию7. Это может свидетельствовать о приобретенном эффекте химиорезистентности ЦОК-спинномозговой жидкости, который будет исследован в будущем.

Далее, в качестве примера того, как PD-CSF-CTC могут быть использованы in vivo, были созданы модели murine-M-LMD путем интратекальной инокуляции различным количеством PD-CSF-CTC. Было определено среднее время выживаемости у мышей (рисунок 3D). Для визуализации прогрессирования М-ЛМД линии PD-CSF-CTC помечали биолюминесцентным маркером, таким как репортерная системаNL 21, и захватывали с помощью BLI (рис. 2C). Расположение метастазов ЛМД также было продемонстрировано с помощью иммуногистохимии с белком мелан-А (MLANA)30 в качестве маркера клеток меланомы (рис. 3E). В качестве доказательства концепции для проверки терапевтических стратегий против M-LMD in vivo когорты M-LMD получали ежедневную пероральную монотерапию церитинибом или траметинибом или комбинацией дабрафениба и траметиниба или церитиниба и траметиниба. Контрольная (нелеченная) когорта получала пероральный физиологический раствор в качестве сравнения. Результаты показали значительно более длительную выживаемость (Рисунок 3F) и более позднее выявление заболевания (Рисунок 3G) в когорте, получавшей церитиниб и траметиниб (средняя выживаемость без лечения М-ЛМД: 28,5 дней по сравнению с церитинибом и траметинибом, получавшими М-ЛМД: 38,5 дней; Значение P = 0,0052). Эти данные подчеркивают потенциальную полезность разработанных линий M-LMD PD-CSF-CTC для проведения доклинических исследований с целью определения эффективности новых методов лечения.

figure-representative results-5524
Рисунок 1: Схематический обзор процесса создания циркулирующих опухолевых клеток PD-CSF-CTC, полученных от пациента. Ликвор у пациентов может быть взят с помощью люмбальной пункции, резервуара Оммайя или быстрого вскрытия. С помощью серии размножений in vitro и in vivo на каждом этапе генерируется промежуточная культура КТК в СМЖ (т.е. ЦОК в СМЖ пациента, культура in vitro , культура in vivo ) до создания линии PD-CSF-CTC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-representative results-6369
Рисунок 2: Примеры культивирования in vitro и in vivo ликворных ЦОК, полученных от пациентов с М-ЛМД. (A) Репрезентативные светлопольные изображения, показывающие рост in vitro колонии M-LMD CSF-CTC через 6 недель и 9 недель в средах, кондиционированных HMC. Масштабная линейка: 1000 мкм. (B) МРТ-снимки через 4 недели и 8 недель после интратекально инокулированной PD-CSF-CTCs; успешное создание мышиной модели M-LMD. Желтые стрелки указывают на увеличенные желудочки и возможную гидроцефалию у этой мыши M-LMD. (C) Репрезентативная BLI-визуализация развития M-LMD у мышей. Рисунок адаптирован из Law et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-representative results-7455
Рисунок 3: Линии PD-CSF-CTC используются в различных доклинических экспериментах для изучения M-LMD. (A) Массив цитокинов человека, демонстрирующий увеличение различных секретируемых факторов роста (т.е. IGFBPs, VEGF-A и GM-CSF) в питательных средах (MenCM) в присутствии менингеальных клеток человека (HMC). (B) Отсканированное изображение анализа пролиферации кристаллических фиолетовых клеток для определения эффективности антител против IGFBP2, тукатиниба и церитиниба против одной из линий PD-CSF-CTC. В контрольном состоянии была проведена обработка транспортного средства. Эксперимент проводили в трех экземплярах. (C) Анализ выживаемости клеток трех различных установленных линий PD-CSF-CTC (у пациентов 09, 12 и 16) in vitro. Клетки обрабатывали либо церитинибом (cer), комбинацией дабрафениба (dab) + траметиниба (tra), cer + tra, либо всеми тремя. Клетки собирали через 72 ч после лечения. Окрашивание кальцеином-АМ использовалось для визуализации жизнеспособности клеток, а анализ МТТ использовался для определения выживаемости клеток. Для статистического анализа был использован парный выборочный t-критерий. Масштабные линейки: 20 мкм. (D) Кривая выживаемости мышиной модели M-LMD. Мышей NSG инокулировали интратекально (через cisterna magna) одной из линий PD-CSF-CTC в 10 000, 20 000 и 50 000 клеток. Была определена медиана выживаемости мышей M-LMD. (E) Обнаружение ИГХ для MLANA, маркера меланомы, в отделах мозга мышей M-LMD. Положительный MLANA был обнаружен в мозговых оболочках (окрашены в красный цвет; заострены желтыми стрелками), в то время как нормальный (здоровый) мозг не показал роста рака (отрицательный для MLANA). Масштабные линейки: 200 мкм. (F) Репрезентативный эксперимент по изучению эффективности мышиных когорт M-LMD, получавших ежедневный пероральный физиологический раствор, cer, tra, dab/tra или cer/tra. Выживаемость мышей была определена. Для статистического анализа использовался логарифмический критерий ранга (Мантела-Кокса). (G) Репрезентативные BLI-изображения прогрессирования M-LMD через 5 недель, сравнение контрольной (физиологической) обработки с Когорты мышей M-LMD, обработанные cer/tra. Панель (C) рисунка адаптирована из Law et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Сводка клинических ЦОК-СМЖ, полученных для посева ex vivo у пациентов с М-ЛМД. Сводная таблица 11 пациентов с М-ЛМД, которых пытались размножить с помощью ЦОК-спинномозговой жидкости. Пациенты в таблице ранее были охарактеризованы в Law et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Discussion

M-LMD является разрушительным, смертельным заболеванием, и существует острая необходимость в поиске лучших стратегий лечения. Одним из основных препятствий для изучения М-ЛМД является невозможность получить достаточное количество ЦОК-ликвора для проведения молекулярных и функциональных исследований 1,7. Несмотря на то, что существуют методы культивирования ЦОК из периферической крови и СМЖ других типов рака, таких как рак молочной железы и яичников 11,31,32, эти методы распространения ЦОК, как правило, краткосрочны, и не сообщалось об успехе культивирования ЦОК-СМЖ из меланомы. Кроме того, современные методологии размножения ЦОК существуют в краткосрочных условиях ex vivo и еще не привели к созданию модели ЛМД in vivo, полученной из клеток ЛМД пациента. Здесь представлен новый протокол культивирования этих клеток in vitro и in vivo, что приводит к созданию уникальных клеточных линий, полученных от пациента. В настоящее время из 11 пациентов с М-ЛМД, участвовавших в исследовании, был примерно 60% (7 из 11) шанс на успех в распространении М-ЛМД СМС-ЦОК IN VITRO, и в то же время он был снижен до ~20% (2 из 11) in vivo с использованием метода CDX7.

Понятно, что условия in vitro не повторяют микроокружение спинномозговой жидкости. Тем не менее, ранее были применены протеомные подходы для изучения белковых компонентов в спинномозговой жидкости и позволили получить некоторое представление о ключевых факторах, необходимых для роста CTC ex vivo3. Например, было выявлено, что один из основных путей, способствующих выживаемости ЦОК у пациентов с М-ЛМД, был связан с повышенной активностью, связанной с ИФР 3,7. Кроме того, исследования показали, что лептоменинги секретируют различные цитокины/факторы роста в спинномозговую жидкость, включая FGF-2, EGF, GM-CSF и белки, связанные с IGF-сигнализацией12. Действительно, это было повторено в средствах массовой информации, культивированных с HMC, поддерживая потенциальную роль этих факторов роста в содействии росту CSF-CTC.

Основным преимуществом создания модели PDX (или CDX) является возможность получить более глубокое представление о патологии заболевания, чего не хватает в условиях in vitro . В идеале предпочтение отдается подходу PDX, поскольку ЦОК в спинномозговой жидкости будут получены непосредственно от пациентов без культивирования ex vivo . Изначально предпринимались попытки создать M-LMD с использованием этого подхода, но до сих пор они не увенчались успехом. Сложность создания мышей PDX, возможно, связана с обилием и целостностью исходного материала (т.е. очень небольшим количеством жизнеспособных ЦОК у пациента с СМЖ при рутинном сборе в клинике). Это может объяснить, почему мы добились больших успехов в выращивании ЦОК из спинномозговой жидкости, собранной при аутопсии7. Чтобы увеличить вероятность распространения in vivo , этот протокол был модифицирован для обеспечения альтернативного подхода CDX. ЦОК-СМЖ могут быть сначала расширены in vitro (шаг 3) для получения линий PD-CSF-CTC, которые имеют долгосрочный и больший потенциал роста. Затем эти клетки инокулируются мышам для создания M-LMD. Несмотря на то, что в рамках данного метода было получено ограниченное количество моделей in vivo CDX M-LMD (~ 20%), это может отражать транскрипционное разнообразие ЦОК-СМЖ, сложность микроокружения СМЖ и сложность культивирования этих клеток в целом. Мы предполагаем, что будущее развитие гуманизированной мышиной модели может повысить вероятность успешного приживления, учитывая важность микроокружения в поддержаниижизнеспособности раковых клеток.

Ограничением подхода CDX является то, что из образцов пациентов были отобраны только определенные клоны, и генетический дрейф раковых клеток в результате культивирования ex vivo может больше не отражать транскрипционный профиль исходного источника. Тем не менее, сообщалось, что, несмотря на культивирование in vitro , линии PD-CSF-CTC сохранили примерно 97% сходства экспрессии генов с изолированными, некультивируемыми ЦОК в спинномозговой жидкости пациентов7. В этом исследовании анализ scRNA-seq выявил перекрывающиеся обогащенные сигнатуры генов между некультивируемыми in vitro PD-CSF-CTC и in vivo PD-CSF-CTC, такими как SOX9, ErbB3 и IGF-1R7, что позволяет предположить, что они могут быть потенциальными терапевтическими мишенями. Кроме того, эти обычно обогащенные гены участвуют в биологических путях, связанных с регуляцией транскрипции и метаболизмом7. В совокупности это подчеркивает трансляционную ценность культур PD-CSF-CTC для лучшего понимания биологии M-LMD, выявления целевых молекулярных механизмов и путей, вызывающих заболевание, а также разработки рациональных методов лечения в будущих исследованиях.

Несмотря на то, что нынешняя методология остается несовершенной, так как нет способа предопределить статус и жизнеспособность ЦОК в спинномозговой жидкости у пациентов с М-ЛМД, было сделано несколько наблюдений, которые могут увеличить вероятность успеха, поскольку ЦОК имеют небольшое количество и довольно хрупкие. Эти важные шаги включают в себя согласование с клиникой для размещения образцов спинномозговой жидкости на льду сразу после их забора и их быстрой транспортировки в лабораторию для поддержания клеточной целостности. Впоследствии ЦОК-СМЖ следует немедленно обработать, либо поместив их в культуру, либо криоконсервировав клетки.

В целом, культивирование и расширение ЦОК-СМЖ было процессом проб и ошибок, но создание этого протокола для создания М-ЛМД, полученных от пациентов, даст исследователям ресурсы, необходимые для проведения экспериментов с образцами пациентов, что было невозможно сделать ранее. Одной из основных целей является использование M-LMD PD-CSF-CTC для проведения молекулярной характеристики, высокопроизводительного скрининга лекарств и исследований эффективности лекарств in vivo для разработки рациональных методов лечения M-LMD. Считается, что такой подход приведет к разработке стратегий лечения, которые значительно снизят заболеваемость и смертность, связанные с этим в настоящее время смертельным аспектом прогрессирующей метастатической меланомы.

Disclosures

Питер Форсайт является членом консультативных советов Abvie Inc, Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen и Ziopharm. Всем остальным авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить пациентов и их семьи за их необычайную щедрость в предоставлении тканей для этого научного исследования. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения P50 CA168536, R21 CA256289, R21 CA216756 (для KSMS и PAF), K99 CA226679 (для IS). Фонд Моффитта по ускорению исследований (в Британскую Колумбию и Пакистан), Программа химической биологии и молекулярной медицины Моффитта (PAF и DD), Фонд Моффитта (PAF). Общие ресурсные ядра по молекулярной геномике, тканям, биоинформатике и биостатистике в Моффитте частично поддерживаются Национальным институтом рака через грант поддержки онкологического центра (P30-CA076292) и Фондом Моффитта.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe 27 - 29 G needlesAny vendorn/a0.1 mm Sterile Filtered
1.5 mL Eppendorf tubesAny vendor
15 ml and 50 mL polystyrene centrifuge tubesAny vendorn/a
6 -  8 weeks females NOD SCID gamma (NSG) miceCharles RiverMales optional
Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR)Zoopharm DEA controlled
Fetal bovine serum (FBS)ScienCell#0010
Gas inhalation anestehsia systemVeteEquip#901812COMPAC5
Hamilton microliter syringesHamilton10, 25, 50, and 100ml30 G for cisterna magna injection
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)Milipore Sigma (or any vender)#F0291
Human epidermal growth factor (EGF)Milipore Sigma (or any vender)#SRP3027
Human meningeal cells (HMCs) isolated from human leptomeningesScienCell#1400
IVIS 200 imaging systemCaliper Life Sciencesn/a
Magnifying glass with lightAny vendorn/a
Meningeal Cell Culture Media (MenCM)ScienCell#1401
Meningeal cell growth supplement (MCGS)ScienCell#1452
MRI imagingBrukerBioSpec seriesOptional
P1000, P200, P20 pipettes/ pipette tips
penicillin-streptomycin Antibiotic solutionScienCell (or any vender)#0503
Phosphate buffered saline (PBS)Any vendorn/a0.1 mm Sterile Filtered
Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps)Roboz Surgical Instrument (or any vendor)
Screw cap cryo tubes 
Sterile blue paper/ drape coveringAny vendorn/an/a
Sterile cotton sticksAny vendorn/a
Tissue culture plates/flasks (96-well, 24-well, 12-well, 6-well, T175 etc.)

References

  1. Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell Melanoma Res. 33 (4), 527-541 (2020).
  2. Khaled, M. L., Tarhini, A. A., Forsyth, P. A., Smalley, I., Pina, Y. Leptomeningeal disease (LMD) in patients with melanoma metastases. Cancers (Basel). 15 (6), 1884 (2023).
  3. Smalley, I., et al. Proteomic analysis of CSF from patients with leptomeningeal melanoma metastases identifies signatures associated with disease progression and therapeutic resistance). Clin Cancer Res. 26 (9), 2163-2175 (2020).
  4. Larkin, J., et al. Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 381, 1535-1546 (2019).
  5. Boire, A., et al. Complement component 3 adapts the cerebrospinal fluid for leptomeningeal metastasis. Cell. 168 (6), 1101-1113 (2017).
  6. Chi, Y., et al. Cancer cells deploy lipocalin-2 to collect limiting iron in leptomeningeal metastasis. Science. 369 (6501), 276-282 (2020).
  7. Law, V., et al. A preclinical model of patient-derived cerebrospinal fluid circulating tumor cells for experimental therapeutics in leptomeningeal disease from melanoma. Neuro Oncol. 24 (10), 1673-1686 (2022).
  8. Carmona-Ule, N., et al. Short-term ex vivo culture of CTCs from advance breast cancer patients: Clinical implications. Cancers (Basel). 13 (11), 2668 (2021).
  9. Zhang, L., et al. The identification and characterization of breast cancer CTCs competent for brain metastasis. Sci Transl Med. 5 (180), (2013).
  10. Yu, M., et al. Cancer therapy: Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
  11. Mohamed, B. M., et al. Ex vivo expansion of circulating tumour cells (CTCs). Sci Rep. 13 (1), 3704 (2023).
  12. Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: From protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
  13. Mercier, F., Hatton, G. I. Connexin 26 and basic fibroblast growth factor are expressed primarily in the subpial and subependymal layers in adult brain parenchyma: Roles in stem cell proliferation and morphological plasticity. J Comp Neurol. 431 (1), 88-104 (2001).
  14. Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (1), 141-145 (1988).
  15. Nordqvist, A. C., Mathiesen, T. Expression of IGF-II, IGFBP-2, -5, and -6 in meningiomas with different brain invasiveness. J Neurooncol. 5, 19-26 (2002).
  16. Zumkeller, W., Westphal, M. The IGF/IGFBP system in CNS malignancy. Mol Pathol. 54 (4), 227-229 (2001).
  17. Wang, L., et al. Promise and limits of the CellSearch platform for evaluating pharmacodynamics in circulating tumor cells. Semin Oncol. 43 (4), 464-475 (2016).
  18. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 8, 160 (2023).
  19. Chen, J., et al. The development and improvement of immunodeficient mice and humanized immune system mouse models. Front Immunol. 13, 1007579 (2022).
  20. Law, V., et al. A Murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033 (2021).
  21. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
  22. Luo, Y. T., et al. The viable circulating tumor cells with cancer stem cells feature, where is the way out. J Exp Clin Cancer Res. 37, 38 (2018).
  23. Stumm, R., Kolodziej, A., Schulz, S., Kohtz, J. D., Hollt, V. Patterns of SDF-1alpha and SDF-1gamma mRNAs, migration pathways, and phenotypes of CXCR4-expressing neurons in the developing rat telencephalon. J Comp Neurol. 502 (3), 382-399 (2007).
  24. Aviezer, D., et al. basal lamina proteoglycan, promotes basic fibroblast growth factor-receptor binding, mitogenesis, and angiogenesis. Cell. 79 (6), 1005-1013 (1994).
  25. Tiwary, S., et al. ERBB3 is required for metastasis formation of melanoma cells. Oncogenesis. 3 (7), e110 (2014).
  26. Sun, X., et al. miR-7 reverses the resistance to BRAFi in melanoma by targeting EGFR/IGF-1R/CRAF and inhibiting the MAPK and PI3K/AKT signaling pathways. Oncotarget. 7 (33), 53558-53570 (2016).
  27. Satyamoorthy, K., Li, G., Vaidya, B., Patel, D., Herlyn, M. Insulin-like growth factor-1 induces survival and growth of biologically early melanoma cells through both the mitogen-activated protein kinase and beta-catenin pathways. Cancer Res. 61 (19), 7318-7324 (2001).
  28. Lin, N. U., et al. Tucatinib vs Placebo, both in combination with Trastuzumab and Capecitabine, for previously treated ERBB2 (HER2)-positive metastatic breast cancer in patients with brain metastases: Updated exploratory analysis of the HER2CLIMB randomized clinical trial. JAMA Oncol. 9 (2), 197-205 (2023).
  29. Russo, A., et al. Ceritinib-induced regression of an insulin-like growth factor-driven neuroepithelial brain tumor. Int J Mol Sci. 20 (17), 4267 (2019).
  30. Ohsie, S. J., Sarantopoulos, G. P., Cochran, A. J., Binder, S. W. Immunohistochemical characteristics of melanoma. J Cutan Pathol. 35 (5), 433-444 (2008).
  31. Kulasinghe, A., et al. Short term ex-vivo expansion of circulating head and neck tumour cells. Oncotarget. 7 (37), 60101-60109 (2016).
  32. Li, X., et al. Clinical significance of detecting CSF-derived tumor cells in breast cancer patients with leptomeningeal metastasis. Oncotarget. 9 (2), 2705-2714 (2018).
  33. Lelliott, E. J., et al. A novel immunogenic mouse model of melanoma for the preclinical assessment of combination targeted and immune-based therapy. Sci Rep. 9 (1), 1225 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ex vivoMAPK

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved