В данной статье описан протокол распространения циркулирующих в спинномозговой жидкости опухолевых клеток (ЦОК) спинномозговой жидкости, собранных у пациентов с меланомально-ассоциированной лептоменингеальной болезнью (М-ЛМД) для разработки доклинических моделей для изучения М-ЛМД.
Меланома-ассоциированная лептоменингеальная болезнь (М-ЛМД) возникает, когда циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) попадают в спинномозговую жидкость (СМЖ) и колонизируют мозговые оболочки, мембранные слои, которые защищают головной и спинной мозг. После установления прогноз для пациентов с М-ЛМД мрачный, общая выживаемость составляет от нескольких недель до месяцев. В первую очередь это связано с недостаточным пониманием болезни и, как следствие, наличием эффективных вариантов лечения. Определение биологии, лежащей в основе М-ЛМД, значительно улучшит способность адаптировать доступные методы лечения М-ЛМД или разработать новые ингибиторы для этого универсально смертельного заболевания. Однако основным препятствием является получение достаточного количества ЦОК из СМЖ пациента (ЦОК-СМЖ) для проведения доклинических экспериментов, таких как молекулярная характеристика, функциональный анализ и исследования эффективности in vivo . Культивирование ЦОК-СМЖ ex vivo также оказалось сложной задачей. Для решения этой проблемы был разработан новый протокол культивирования полученных от пациента M-LMD CSF-CTC EX VIVO и in vivo . Включение кондиционированных сред, продуцируемых менингеальными клетками человека (ММК), имеет решающее значение для процедуры. Анализ цитокиновых матриц показывает, что факторы, продуцируемые ГМК, такие как инсулиноподобные белки, связывающие фактор роста (IGFBP) и фактор роста эндотелия сосудов-А (VEGF-A), играют важную роль в обеспечении выживаемости ликвора-CTC ex vivo. В данной работе продемонстрирована полезность выделенных у пациента линий СМЖ-ЦТК при определении эффективности ингибиторов, нацеленных на сигнальные пути инсулиноподобного фактора роста (ИФР) и митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK). Кроме того, показана способность интратекально инокулировать эти клетки in vivo для создания мышиных моделей M-LMD, которые могут быть использованы для доклинических испытаний одобренных или новых методов лечения. Эти инструменты могут помочь разгадать основную биологию, определяющую образование ликвора-КТК в мозговых оболочках, и определить новые методы лечения для снижения заболеваемости и смертности, связанных с М-ЛМД.
Лептоменингеальная болезнь (ЛМД) возникает, когда циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) диссессируются в спинномозговую жидкость (СМЖ) и образуются в мозговых оболочках, оболочке, окружающих головной и спинной мозг 1,2. ЛМД может возникать при нескольких видах рака, но особенно распространен при меланоме. На поздних стадиях меланомы примерно у 5% пациентов развивается меланома-ассоциированный M-LMD 2,3. Несмотря на относительно низкие показатели по сравнению с другими местами метастазирования, последствия М-ЛМД являются разрушительными, общая выживаемость составляет от нескольких недель до нескольких месяцев, и они вносят значительный вклад в заболеваемость пациентов 1,3,4. В первую очередь это связано с нехваткой эффективных вариантов лечения в сочетании с серьезными пробелами в наших знаниях о том, как лептоменинги колонизируются клетками меланомы2. Таким образом, понимание биологии M-LMD будет способствовать разработке новых методов лечения для улучшения клинических результатов.
Недавние исследования показали, как ЦОК колонизируют уникальное микроокружение спинномозговой жидкости. Например, комплемент С3 способствует инвазии опухолевых клеток в спинномозговую жидкость через сосудистое сплетение, сложную сеть кровеносных сосудов в каждом желудочкемозга. Кроме того, в ответ на дефицит микронутриентов в спинномозговой жидкости, ЦОК могут повышать уровень липокалина-2, белка, поглощающего железо, и его рецепторные SLC22A17 дляповышения выживаемости. Используя анализ ликвора на основе омики , наша группа также обнаружила, что спинномозговая жидкость обогащена белками, которые регулируют передачу сигналов инсулиноподобного фактора роста (ИФР), а также врожденный иммунитет3. В совокупности эти данные подчеркивают ценность ЦОК-СМЖ из жидкостных биопсий для изучения М-ЛМД.
Несмотря на то, что ЦОК в спинномозговой жидкости иногда можно идентифицировать путем взятия образцов спинномозговой жидкости пациента с помощью люмбальной пункции, резервуара Оммайя или быстрого вскрытия, основным ограничением является получение достаточного количества этих редких и хрупких клеток 1,7. Например, при использовании метода подсчета КТК можно идентифицировать только от нескольких сотен до нескольких тысяч опухолевых клеток на один образец7 ликвора пациента, что затрудняет проведение молекулярного и функционального анализа in vitro или in vivo. Несмотря на то, что были сообщения об успешном кратковременном выращивании ЦОК ex vivo из периферической крови (т.е. ЦОК рака молочной железы)8,9,10, эти клетки обычно растут только в краткосрочной перспективе, и не было зарегистрировано ни одного случая возможности выращивания ЦОК меланомы в спинномозговой жидкости. Следовательно, поиск способов размножения меланомы СМФ-ЦОК, или ЦОК в целом, будет очень полезен для изучения биологии M-LMD 7,11.
Впервые описана новая методика размножения ЦОК в спинномозговой жидкости от пациентов с М-ЛМД ex vivo. В этом отчете был разработан подробный протокол, который позволяет проводить культивирование и расширение ЦОК в спинномозговой жидкости у пациентов с М-ЛМД. Поскольку мозговые оболочки секретируют различные факторы роста, такие как FGF, IGF, VEGF-A и IGFBPs, которые поддерживают рост окружающей их среды 12,13,14,15,16, было обосновано, что ЦОК-СМЖ могут требовать этих компонентов для роста в условиях ex vivo. Таким образом, в этом протоколе используются кондиционированные среды, полученные путем культивирования менингеальных клеток человека (HMCs-) in vitro. Для инокуляции in vivo клетки, полученные от пациента, инокулируются мышам с иммунодефицитом для получения линий ЦОК-СМК (PD-CSF-CTC) от пациента. Доступность М-ЛМД, полученных от пациентов, будет способствовать клеточным, молекулярным и функциональным анализам для изучения М-ЛМД и предложит новые стратегии лечения этого смертельного заболевания.
Сбор образцов обезличенных ликворов пациентов был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) Университета Южной Флориды (MCC 50103, 50172 и 19332). Пациенты с М-ЛМД могут быть диагностированы несколькими способами, включая положительную цитологию ликвора, характерную магнитно-резонансную томографию (МРТ) головного мозга и/или позвоночника или комбинацию клинических данных с наводящими на размышления результатами МРТ. Спинномозговая жидкость у этих пациентов с М-ЛМД была собрана в обычном порядке в рамках стандартного клинического лечения. Никакая процедура не проводится без клинических показаний. От пациентов было получено информированное согласие на сбор образцов и их использование в исследованиях и публикациях. Создание моделей in vivo murine-LMD было одобрено Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Южной Флориды (IACUC# IS00010398). Общая схема этого протокола представлена на рисунке 1. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка сред, кондиционированных HMC
2. Сбор СМЖ и обработка образцов
3. Культивирование in vitro и экспансия ЦОК-СМЖ
4. Инокуляция ЦОК-ликвора in vivo для получения ксенотрансплантата, полученного из клеточной линии (CDX) или модели ксенотрансплантата, полученного от пациента (PDX)
Примечание: Модель PDX включает в себя приживление раковых клеток непосредственно от больного раком (без культивирования ex vivo), в то время как модель CDX использует линии раковых клеток или, в данном случае, ЦОК, которые были размножены и увековечены.
5. Сбор спинномозговой жидкости у мышей с ЛМД для последующего клонирования
Понимание требований для успешного роста ЦОК-СМЖ ex vivo является постоянной задачей. В связи с этим считается, что обеспечение существенных факторов, имитирующих микросреду СМЖ, имеет ключевое значение22. Менингеальные клетки человека (МЦК) секретируют различные факторы роста в СМЖ, включая FGF-2, EGF, IGFBP2 и IGFBP6, и, как известно, поддерживают рост клеток ЦОК 12,13,14,23,24. Поэтому был проведен анализ цитокинового массива человека на средах, кондиционированных HMC, чтобы определить потенциально важные компоненты, необходимые для выживания CTC. Действительно, несколько факторов роста были активированы в средах, культивируемых с помощью HMC (Рисунок 3A). Например, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), VEGF-A и IGFBP (IGFBP2, 3, 4 и 6).
Клеточные компоненты спинномозговой жидкости пациентов могут состоять из нескольких типов клеток, таких как ЦОК, иммунные клетки и фибробласты. Не-CTC в конечном итоге перестанут пропускать со временем. Как правило, клетки, которые успешно размножаются и остаются в пролиферации, являются раковыми клетками (M-LMD). Валидация растущих клеток в культуре действительно представляет собой клетки M-LMD, что может быть сделано путем обнаружения экспрессии MLANA методом IF и транскриптомного анализа, чтобыло показано ранее.
В качестве доказательства концепции, демонстрирующей потенциальное использование и применение установленных линий PD-CSF-CTC IN VITRO и in vivo, был использован анализ секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq), и в результате было выявлено несколько генов, которые были обогащены и сохранены у некультивируемых пациентов с CSF-CTCs7. Два из них включают рецептор тирозин-протеинкиназы ErbB3 и IGF-1R, которые влияют на прогрессирование меланомы и резистентность к химиотерапии 25,26,27.
Чтобы проверить, играют ли они роль в выживаемости CSF-CTC, был проведен анализ пролиферации кристаллического фиалка на PD-CSF-CTCs, обработанных одобренными FDA препаратами тукатинибом и церитинибом, которые нацелены на ErbB28 и IGF-1R 7,29 соответственно. Антитела к IGFBP2 были включены в качестве положительного контроля, который должен препятствовать росту культур PD-CSF-CTC. Результаты показали, что отсутствие IGFBP2 или IGF-1R было эффективным в снижении пролиферации PD-CSF-CTC (рисунок 3B). Учитывая, что передача сигналов MAPK происходит после IGF-1R, окрашивание живых клеток кальцеином-AM и анализ выживаемости клеток МТТ также были проведены в трех линиях M-LMD PD-CSF-CTC путем обработки их церитинибом или ингибиторами MAPK, дабрафенибом и траметинибом или комбинацией всех трех. Данные показали, что церитиниб значительно снижает жизнеспособность всех трех клеточных линий, в то время как дабрафениб и траметиниб имеют смешанные эффекты (рис. 3C). Результат лечения дебрафенибом и траметинибом был удивительным. Все три линии PD-CSF-CTC были получены от пациентов с M-LMD, которые несли BRAFV600E мутацию7. Это может свидетельствовать о приобретенном эффекте химиорезистентности ЦОК-спинномозговой жидкости, который будет исследован в будущем.
Далее, в качестве примера того, как PD-CSF-CTC могут быть использованы in vivo, были созданы модели murine-M-LMD путем интратекальной инокуляции различным количеством PD-CSF-CTC. Было определено среднее время выживаемости у мышей (рисунок 3D). Для визуализации прогрессирования М-ЛМД линии PD-CSF-CTC помечали биолюминесцентным маркером, таким как репортерная системаNL 21, и захватывали с помощью BLI (рис. 2C). Расположение метастазов ЛМД также было продемонстрировано с помощью иммуногистохимии с белком мелан-А (MLANA)30 в качестве маркера клеток меланомы (рис. 3E). В качестве доказательства концепции для проверки терапевтических стратегий против M-LMD in vivo когорты M-LMD получали ежедневную пероральную монотерапию церитинибом или траметинибом или комбинацией дабрафениба и траметиниба или церитиниба и траметиниба. Контрольная (нелеченная) когорта получала пероральный физиологический раствор в качестве сравнения. Результаты показали значительно более длительную выживаемость (Рисунок 3F) и более позднее выявление заболевания (Рисунок 3G) в когорте, получавшей церитиниб и траметиниб (средняя выживаемость без лечения М-ЛМД: 28,5 дней по сравнению с церитинибом и траметинибом, получавшими М-ЛМД: 38,5 дней; Значение P = 0,0052). Эти данные подчеркивают потенциальную полезность разработанных линий M-LMD PD-CSF-CTC для проведения доклинических исследований с целью определения эффективности новых методов лечения.
Рисунок 1: Схематический обзор процесса создания циркулирующих опухолевых клеток PD-CSF-CTC, полученных от пациента. Ликвор у пациентов может быть взят с помощью люмбальной пункции, резервуара Оммайя или быстрого вскрытия. С помощью серии размножений in vitro и in vivo на каждом этапе генерируется промежуточная культура КТК в СМЖ (т.е. ЦОК в СМЖ пациента, культура in vitro , культура in vivo ) до создания линии PD-CSF-CTC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Примеры культивирования in vitro и in vivo ликворных ЦОК, полученных от пациентов с М-ЛМД. (A) Репрезентативные светлопольные изображения, показывающие рост in vitro колонии M-LMD CSF-CTC через 6 недель и 9 недель в средах, кондиционированных HMC. Масштабная линейка: 1000 мкм. (B) МРТ-снимки через 4 недели и 8 недель после интратекально инокулированной PD-CSF-CTCs; успешное создание мышиной модели M-LMD. Желтые стрелки указывают на увеличенные желудочки и возможную гидроцефалию у этой мыши M-LMD. (C) Репрезентативная BLI-визуализация развития M-LMD у мышей. Рисунок адаптирован из Law et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Линии PD-CSF-CTC используются в различных доклинических экспериментах для изучения M-LMD. (A) Массив цитокинов человека, демонстрирующий увеличение различных секретируемых факторов роста (т.е. IGFBPs, VEGF-A и GM-CSF) в питательных средах (MenCM) в присутствии менингеальных клеток человека (HMC). (B) Отсканированное изображение анализа пролиферации кристаллических фиолетовых клеток для определения эффективности антител против IGFBP2, тукатиниба и церитиниба против одной из линий PD-CSF-CTC. В контрольном состоянии была проведена обработка транспортного средства. Эксперимент проводили в трех экземплярах. (C) Анализ выживаемости клеток трех различных установленных линий PD-CSF-CTC (у пациентов 09, 12 и 16) in vitro. Клетки обрабатывали либо церитинибом (cer), комбинацией дабрафениба (dab) + траметиниба (tra), cer + tra, либо всеми тремя. Клетки собирали через 72 ч после лечения. Окрашивание кальцеином-АМ использовалось для визуализации жизнеспособности клеток, а анализ МТТ использовался для определения выживаемости клеток. Для статистического анализа был использован парный выборочный t-критерий. Масштабные линейки: 20 мкм. (D) Кривая выживаемости мышиной модели M-LMD. Мышей NSG инокулировали интратекально (через cisterna magna) одной из линий PD-CSF-CTC в 10 000, 20 000 и 50 000 клеток. Была определена медиана выживаемости мышей M-LMD. (E) Обнаружение ИГХ для MLANA, маркера меланомы, в отделах мозга мышей M-LMD. Положительный MLANA был обнаружен в мозговых оболочках (окрашены в красный цвет; заострены желтыми стрелками), в то время как нормальный (здоровый) мозг не показал роста рака (отрицательный для MLANA). Масштабные линейки: 200 мкм. (F) Репрезентативный эксперимент по изучению эффективности мышиных когорт M-LMD, получавших ежедневный пероральный физиологический раствор, cer, tra, dab/tra или cer/tra. Выживаемость мышей была определена. Для статистического анализа использовался логарифмический критерий ранга (Мантела-Кокса). (G) Репрезентативные BLI-изображения прогрессирования M-LMD через 5 недель, сравнение контрольной (физиологической) обработки с Когорты мышей M-LMD, обработанные cer/tra. Панель (C) рисунка адаптирована из Law et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Таблица 1: Сводка клинических ЦОК-СМЖ, полученных для посева ex vivo у пациентов с М-ЛМД. Сводная таблица 11 пациентов с М-ЛМД, которых пытались размножить с помощью ЦОК-спинномозговой жидкости. Пациенты в таблице ранее были охарактеризованы в Law et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
M-LMD является разрушительным, смертельным заболеванием, и существует острая необходимость в поиске лучших стратегий лечения. Одним из основных препятствий для изучения М-ЛМД является невозможность получить достаточное количество ЦОК-ликвора для проведения молекулярных и функциональных исследований 1,7. Несмотря на то, что существуют методы культивирования ЦОК из периферической крови и СМЖ других типов рака, таких как рак молочной железы и яичников 11,31,32, эти методы распространения ЦОК, как правило, краткосрочны, и не сообщалось об успехе культивирования ЦОК-СМЖ из меланомы. Кроме того, современные методологии размножения ЦОК существуют в краткосрочных условиях ex vivo и еще не привели к созданию модели ЛМД in vivo, полученной из клеток ЛМД пациента. Здесь представлен новый протокол культивирования этих клеток in vitro и in vivo, что приводит к созданию уникальных клеточных линий, полученных от пациента. В настоящее время из 11 пациентов с М-ЛМД, участвовавших в исследовании, был примерно 60% (7 из 11) шанс на успех в распространении М-ЛМД СМС-ЦОК IN VITRO, и в то же время он был снижен до ~20% (2 из 11) in vivo с использованием метода CDX7.
Понятно, что условия in vitro не повторяют микроокружение спинномозговой жидкости. Тем не менее, ранее были применены протеомные подходы для изучения белковых компонентов в спинномозговой жидкости и позволили получить некоторое представление о ключевых факторах, необходимых для роста CTC ex vivo3. Например, было выявлено, что один из основных путей, способствующих выживаемости ЦОК у пациентов с М-ЛМД, был связан с повышенной активностью, связанной с ИФР 3,7. Кроме того, исследования показали, что лептоменинги секретируют различные цитокины/факторы роста в спинномозговую жидкость, включая FGF-2, EGF, GM-CSF и белки, связанные с IGF-сигнализацией12. Действительно, это было повторено в средствах массовой информации, культивированных с HMC, поддерживая потенциальную роль этих факторов роста в содействии росту CSF-CTC.
Основным преимуществом создания модели PDX (или CDX) является возможность получить более глубокое представление о патологии заболевания, чего не хватает в условиях in vitro . В идеале предпочтение отдается подходу PDX, поскольку ЦОК в спинномозговой жидкости будут получены непосредственно от пациентов без культивирования ex vivo . Изначально предпринимались попытки создать M-LMD с использованием этого подхода, но до сих пор они не увенчались успехом. Сложность создания мышей PDX, возможно, связана с обилием и целостностью исходного материала (т.е. очень небольшим количеством жизнеспособных ЦОК у пациента с СМЖ при рутинном сборе в клинике). Это может объяснить, почему мы добились больших успехов в выращивании ЦОК из спинномозговой жидкости, собранной при аутопсии7. Чтобы увеличить вероятность распространения in vivo , этот протокол был модифицирован для обеспечения альтернативного подхода CDX. ЦОК-СМЖ могут быть сначала расширены in vitro (шаг 3) для получения линий PD-CSF-CTC, которые имеют долгосрочный и больший потенциал роста. Затем эти клетки инокулируются мышам для создания M-LMD. Несмотря на то, что в рамках данного метода было получено ограниченное количество моделей in vivo CDX M-LMD (~ 20%), это может отражать транскрипционное разнообразие ЦОК-СМЖ, сложность микроокружения СМЖ и сложность культивирования этих клеток в целом. Мы предполагаем, что будущее развитие гуманизированной мышиной модели может повысить вероятность успешного приживления, учитывая важность микроокружения в поддержаниижизнеспособности раковых клеток.
Ограничением подхода CDX является то, что из образцов пациентов были отобраны только определенные клоны, и генетический дрейф раковых клеток в результате культивирования ex vivo может больше не отражать транскрипционный профиль исходного источника. Тем не менее, сообщалось, что, несмотря на культивирование in vitro , линии PD-CSF-CTC сохранили примерно 97% сходства экспрессии генов с изолированными, некультивируемыми ЦОК в спинномозговой жидкости пациентов7. В этом исследовании анализ scRNA-seq выявил перекрывающиеся обогащенные сигнатуры генов между некультивируемыми in vitro PD-CSF-CTC и in vivo PD-CSF-CTC, такими как SOX9, ErbB3 и IGF-1R7, что позволяет предположить, что они могут быть потенциальными терапевтическими мишенями. Кроме того, эти обычно обогащенные гены участвуют в биологических путях, связанных с регуляцией транскрипции и метаболизмом7. В совокупности это подчеркивает трансляционную ценность культур PD-CSF-CTC для лучшего понимания биологии M-LMD, выявления целевых молекулярных механизмов и путей, вызывающих заболевание, а также разработки рациональных методов лечения в будущих исследованиях.
Несмотря на то, что нынешняя методология остается несовершенной, так как нет способа предопределить статус и жизнеспособность ЦОК в спинномозговой жидкости у пациентов с М-ЛМД, было сделано несколько наблюдений, которые могут увеличить вероятность успеха, поскольку ЦОК имеют небольшое количество и довольно хрупкие. Эти важные шаги включают в себя согласование с клиникой для размещения образцов спинномозговой жидкости на льду сразу после их забора и их быстрой транспортировки в лабораторию для поддержания клеточной целостности. Впоследствии ЦОК-СМЖ следует немедленно обработать, либо поместив их в культуру, либо криоконсервировав клетки.
В целом, культивирование и расширение ЦОК-СМЖ было процессом проб и ошибок, но создание этого протокола для создания М-ЛМД, полученных от пациентов, даст исследователям ресурсы, необходимые для проведения экспериментов с образцами пациентов, что было невозможно сделать ранее. Одной из основных целей является использование M-LMD PD-CSF-CTC для проведения молекулярной характеристики, высокопроизводительного скрининга лекарств и исследований эффективности лекарств in vivo для разработки рациональных методов лечения M-LMD. Считается, что такой подход приведет к разработке стратегий лечения, которые значительно снизят заболеваемость и смертность, связанные с этим в настоящее время смертельным аспектом прогрессирующей метастатической меланомы.
Мы хотели бы поблагодарить пациентов и их семьи за их необычайную щедрость в предоставлении тканей для этого научного исследования. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения P50 CA168536, R21 CA256289, R21 CA216756 (для KSMS и PAF), K99 CA226679 (для IS). Фонд Моффитта по ускорению исследований (в Британскую Колумбию и Пакистан), Программа химической биологии и молекулярной медицины Моффитта (PAF и DD), Фонд Моффитта (PAF). Общие ресурсные ядра по молекулярной геномике, тканям, биоинформатике и биостатистике в Моффитте частично поддерживаются Национальным институтом рака через грант поддержки онкологического центра (P30-CA076292) и Фондом Моффитта.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL syringe 27 - 29 G needles | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile Filtered |
1.5 mL Eppendorf tubes | Any vendor | ||
15 ml and 50 mL polystyrene centrifuge tubes | Any vendor | n/a | |
6 - 8 weeks females NOD SCID gamma (NSG) mice | Charles River | Males optional | |
Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
Fetal bovine serum (FBS) | ScienCell | #0010 | |
Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100ml | 30 G for cisterna magna injection |
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Milipore Sigma (or any vender) | #F0291 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Milipore Sigma (or any vender) | #SRP3027 | |
Human meningeal cells (HMCs) isolated from human leptomeninges | ScienCell | #1400 | |
IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
Meningeal Cell Culture Media (MenCM) | ScienCell | #1401 | |
Meningeal cell growth supplement (MCGS) | ScienCell | #1452 | |
MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
P1000, P200, P20 pipettes/ pipette tips | |||
penicillin-streptomycin Antibiotic solution | ScienCell (or any vender) | #0503 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile Filtered |
Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
Screw cap cryo tubes | |||
Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a | |
Tissue culture plates/flasks (96-well, 24-well, 12-well, 6-well, T175 etc.) |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved