הדמיה מרובת תאים חיים לתגובות תרופתיות במודלים אורגנואידים שמקורם בחולה של סרטן

Summary

אורגנואידים סרטניים שמקורם בחולה הם מערכת מודל מתוחכמת למחקר בסיסי ותרגומי. מאמר שיטות זה מפרט את השימוש בדימות תאים חיים פלואורסצנטיים מרובים להערכה קינטית בו זמנית של פנוטיפים אורגנואידים שונים.

Abstract

מודלים אורגנואידים הנגזרים ממטופל (PDO) של סרטן הם מערכת מחקר רב-תכליתית המשחזרת טוב יותר מחלות אנושיות בהשוואה לשורות תאים סרטניים. מודלים של PDO יכולים להיווצר על ידי תרבית תאי גידול של חולים בתמציות קרום מרתף חוץ-תאיות (BME) וציפוים ככיפות תלת-ממדיות. עם זאת, ריאגנטים זמינים מסחרית אשר עברו אופטימיזציה עבור בדיקות פנוטיפיות בתרבויות monolayer לעתים קרובות אינם תואמים BME. במאמר זה, אנו מתארים שיטה להצלחת מודלים של PDO ולהערכת השפעות של תרופות באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית של תאים חיים. בנוסף, אנו מיישמים צבעים פלואורסצנטיים התואמים למדידות קינטיות כדי לכמת את בריאות התא ואת האפופטוזיס בו זמנית. ניתן להתאים אישית לכידת תמונה כך שתתרחש במרווחי זמן קבועים במשך מספר ימים. משתמשים יכולים לנתח השפעות של סמים בתמונות בודדות של מישור Z או הקרנת Z של תמונות טוריות ממישורי מוקד מרובים. באמצעות מיסוך מחושבים פרמטרים ספציפיים של עניין, כגון מספר PDO, שטח ועוצמת פלואורסצנטיות. אנו מספקים נתוני הוכחת היתכנות המדגימים את ההשפעה של חומרים ציטוטוקסיים על בריאות התא, אפופטוזיס וכדאיות. ניתן להרחיב פלטפורמת הדמיה קינטית אוטומטית זו לקריאות פנוטיפיות אחרות כדי להבין השפעות טיפוליות מגוונות במודלים של סרטן PDO.

Introduction

אורגנואידים סרטניים שמקורם בחולה (PDOs) מתפתחים במהירות כמערכת מודל חזקה לחקר התפתחות סרטן ותגובות טיפוליות. PDOs הן מערכות תרבית תאים תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) המשחזרות את הפרופיל הגנומי המורכב ואת הארכיטקטורה של הגידול הראשוני ^1,2. שלא כמו תרביות דו-ממדיות מסורתיות (2D) של קווי תאים סרטניים אימורטליים, PDOs לוכדים ושומרים על הטרוגניות תוך-גידולית ^3,4, מה שהופך אותם לכלי רב ערך הן למחקר מכניסטי והן למחקר תרגומי. למרות ש-PDOs הופכים למערכת מודל פופולרית יותר ויותר, ריאגנטים זמינים מסחרית ושיטות ניתוח עבור אפקטים תאיים התואמים לתרביות PDO מוגבלים.

Protocol

מחקרים המשתמשים בדגימות גידול אנושי נבדקו ואושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת איווה (IRB), פרוטוקול #201809807, ובוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים כפי שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ותיקוניה המאוחרים יותר. הסכמה מדעת התקבלה מכל הנבדקים שהשתתפו במחקר. קריטריוני ההכללה כוללים אבחנה של סר.......

Discussion

תרביות PDO הופכות לפופולריות יותר ויותר במערכת מודל במבחנה בשל יכולתן לשקף תגובות והתנהגויות תאיות². התקדמות משמעותית נעשתה ביצירת PDO, בתרבות ובטכניקות הרחבה, אך שיטות לניתוח תגובות טיפוליות התמהמהו. ערכות כדאיות תלת-ממדיות הזמינות באופן מסחרי הן מבחני נקודות קצה ליטיים, מחמי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)