Мультиплексная визуализация живых клеток для реакции на лекарственные препараты в органоидных моделях рака, полученных от пациентов

Summary

Органоиды опухолей, полученные от пациентов, представляют собой сложную модельную систему для фундаментальных и трансляционных исследований. В данной методе подробно описано использование мультиплексной флуоресцентной визуализации живых клеток для одновременной кинетической оценки различных органоидных фенотипов.

Abstract

Органоидные модели рака, полученные от пациента (PDO), представляют собой многофункциональную исследовательскую систему, которая лучше повторяет заболевание человека по сравнению с линиями раковых клеток. Модели PDO могут быть созданы путем культивирования опухолевых клеток пациента в экстрактах внеклеточной базальной мембраны (BME) и покрытия их в виде трехмерных куполов. Однако коммерчески доступные реагенты, оптимизированные для фенотипического анализа в монослойных культурах, часто несовместимы с БМЭ. В этой статье мы опишем метод планшетирования моделей PDO и оценки эффектов лекарств с помощью автоматизированной системы визуализации живых клеток. Кроме того, мы применяем флуоресцентные красители, совместимые с кинетическими измерениями, для количественной оценки здоровья клеток и апоптоза одновременно. Захват изображений можно настроить так, чтобы он происходил через регулярные промежутки времени в течение нескольких дней. Пользователи могут анализировать действие лекарств на отдельных изображениях в Z-плоскости или Z-проекции последовательных изображений из нескольких фокальных плоскостей. С помощью маскировки вычисляются конкретные интересующие параметры, такие как число PDO, площадь и интенсивность флуоресценции. Мы предоставляем экспериментальные данные, демонстрирующие влияние цитотоксических агентов на здоровье, апоптоз и жизнеспособность клеток. Эта автоматизированная платформа кинетической визуализации может быть расширена для других фенотипических считываний для понимания различных терапевтических эффектов в моделях рака PDO.

Introduction

Органоиды опухолей, полученные от пациентов (PDO), быстро становятся надежной модельной системой для изучения развития рака и терапевтических реакций. PDO представляют собой трехмерные (3D) системы культивирования клеток, которые повторяют сложный геномный профиль и архитектуру первичной опухоли ^1,2. В отличие от традиционных двумерных (2D) культур иммортализированных раковых клеточных линий, PDO захватывают и поддерживают внутриопухолевую гетерогенность ^3,4, что делает их ценным инструментом как для механистических, так и для трансляционных исследован....

Protocol

Исследования с использованием образцов опухолей человека были рассмотрены и одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Айовы (IRB), протокол #201809807, и проведены в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и более поздних п.......

Discussion

Культуры PDO становятся все более популярными модельными системами in vitro из-за их способности отражать клеточные реакции и поведение². Были достигнуты значительные успехи в генерации, культуре и методах расширения PDO, однако методы анализа терапевтических ответов отстают. К.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)