Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להשגה וטיפוח של תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים (RPE) מעיניים חזיריות ממקור מקומי. תאים אלו מהווים חלופה איכותית לתאי גזע ומתאימים למחקר רשתית במבחנה .

Abstract

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבה חיונית ברשתית החיצונית האחראית לתמיכה בפוטורצפטורים. ניוון RPE מתרחש בדרך כלל במחלות המסומנות על ידי אובדן ראייה מתקדם, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD). מחקר על AMD מסתמך לעתים קרובות על עיניים מתורם אנושי או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) כדי לייצג את RPE. עם זאת, מקורות RPE אלה דורשים תקופות בידול ממושכות ומומחיות משמעותית לטיפוח. בנוסף, לחלק ממוסדות המחקר, במיוחד אלה באזורים כפריים, אין גישה נוחה לעיני התורם. בעוד קו תאי RPE אימורטלי זמין מסחרית (ARPE-19) קיים, הוא חסר תכונות RPE חיוניות in vivo ואינו מקובל באופן נרחב בפרסומים מחקריים רבים בתחום רפואת העיניים. יש צורך דחוף להשיג תאי RPE ראשוניים מייצגים ממקור זמין וחסכוני יותר. פרוטוקול זה מבהיר את הבידוד ותת-התרבות של תאי RPE ראשוניים המתקבלים לאחר המוות מעיניים חזיריות, אשר ניתן להשיג באופן מקומי מספקים מסחריים או אקדמיים. פרוטוקול זה מחייב חומרים נפוצים הנמצאים בדרך כלל במעבדות לתרביות רקמה. התוצאה היא חלופה ראשונית, מובחנת וחסכונית לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), עיני תורם אנושי ותאי ARPE-19.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי הממוקם ברשתית החיצונית בין קרום ברוך לבין הפוטורצפטורים1. תאי RPE יוצרים צמתים הדוקים עם חלבונים כגון zonula occludens-1 (ZO-1) ובעלי פנוטיפ ייחודי המאופיין בפיגמנטציה ומורפולוגיה משושה 2,3. תאים אלה תורמים למחסום הדם-רשתית, ובכך תומכים בבריאות קולטני האור ושומרים על הומאוסטזיס רשתית 4,5. בנוסף, תאי RPE ממלאים תפקיד קריטי בראייה על ידי קליטת אור ומיחזור רכיבים חיוניים עבור קולטני האור6. לדוגמה, RPE65, חלבון המתבטא היטב בתאי RPE, ממיר אסטרי רטיניל all-trans לרטינול 11....

Protocol

העיניים המשמשות בהליך זה מתקבלות לאחר המוות מאטליז מקומי, שנבדק על ידי משרד החקלאות האמריקאי, ולא מתבצעת עבודה באמצעות בעלי חיים חיים. לאחר הקרבת בעלי החיים, חולפות כשעתיים עד שהעיניים מתחנכות. כמו ריקבון רקמות עלול להתחיל להתרחש, חשוב לשמור על העיניים קריר במהלך ההובלה כדי למנוע ריקבון נ?.......

Representative Results

באמצעות הליך זה, תאי RPE ראשוניים בודדו בהצלחה מעיניים חזיריות. איור 1A מראה תאי RPE 3 ימים לאחר בידוד עם פיגמנטציה אופיינית. לאחר שבוע אחד של גדילה, התאים נפגשו באופן מלא ויצרו שכבה חד-שכבתית בריאה (איור 1B). התאים הועברו לאחר מכן לתוספות תרבית תאים, שם הם שמרו על ה.......

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד תאי RPE מעיניים חזיריות. פיגמנטציה ומורפולוגיה מרוצפת נראים בתוך 7 ימים של בידוד (איור 1B). יתר על כן, נתוני TEER מצביעים על היווצרות צומת הדוקה22 וחד-שכבה בריאה (איור 5). תוצאות אלה מראות כי תאי RPE שבודדו בשיטה זו דומים ל-RPE אנ.......

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לפרהאד פרג'וד על העזרה בתרבית תאי RPE חזיריים ובידודם, ולתומאס האריס על העזרה עם SEM. המחברים מודים על התמיכה של מתקן הליבה מיקרוסקופיה באוניברסיטת מדינת יוטה לניתוח SEM. המתקן מחזיק במיקרוסקופ אלקטרונים סורק שנרכש באמצעות מענק מכשור מחקר מרכזי של הקרן הלאומית למדע (CMMI-1337932). המימון למחקר זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענק 1R15EY028732 (Vargis) ומענק קרן BrightFocus M2019109 (Vargis). מימון נוסף ניתן על ידי מענק מחקר והזדמנויות יצירתיות לתואר ראשון (Weatherston) ממשרד המחקר של אוניברסיטת מדינת יוטה ומענק זרע (Vargis) מהמרכז לחקר מחלת האלצהיימר והדמנציה של אוניברסיטת יוטה.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glassCellvisP06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%Alfa AesarL13191.30
Cell StrainerFisher Scientific 22-363-548one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mLFisher Scientific 05-539-12
Cooler, 8 LIgloo32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane InsertsFisher Scientific 07-200-154Culture inserts
Cut Resistant GloveDowellife712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, SolutionFisher Scientific SH3026401for ICC dilutions only 
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvateCorning10-013-CV
DNase I from Bovine PancreasSigma AldrichDN25
DPBS/Modified - calcium - magnesiumCytivaSH3002B.02stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER deviceWorld Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free PowderFisher Scientific BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChemFisher Scientific LC146501
Gauze SpongesFisher Scientific 22-415-504One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, InvitrogenThermo ScientificA32728RPE65 secondary antibody
Ice Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)Fisher Scientific R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"Cole-PalmerEW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten CarbideFisher Scientific 50-822-379
LSM-710 Confocal MicroscopeZeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm Corning430167one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste 
Povidone-Iondine Solution, 10%Equate49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), InvitrogenThermo ScientificMA116578RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10Fisher Scientific 22-079-683
Scalpel Handles Style 3Fisher Scientific 50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"Fisher Scientific 50-209-1792
Tissue Culture Incubator37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 WellsVWR10062-892One for eye wash and one for seeding 
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mLFisher Scientific 14-955-111F
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium BicarbonateCorning25053Cl
Tweezers Style 20AFisher Scientific 17-467-231
Tweezers Style 2AFisher Scientific 50-238-47for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PIFisher Scientific 17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, InvitrogenFisher Scientific 33-911-1ZO-1 conjugated primary antibody

References

  1. Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
  2. Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium p....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

207

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved