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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve o procedimento para obtenção e cultivo de células epiteliais pigmentares primárias da retina (EPR) a partir de olhos suínos de origem local. Essas células servem como uma alternativa de alta qualidade às células-tronco e são adequadas para pesquisas in vitro da retina.

Abstract

O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada crucial na retina externa responsável pela sustentação dos fotorreceptores. A degeneração do EPR ocorre comumente em doenças marcadas pela perda progressiva da visão, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). A pesquisa sobre DMRI geralmente se baseia em olhos de doadores humanos ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para representar o EPR. No entanto, essas fontes de EPR requerem longos períodos de diferenciação e conhecimentos substanciais para o cultivo. Além disso, algumas instituições de pesquisa, particularmente aquelas em áreas rurais, não têm fácil acesso aos olhos dos doadores. Embora exista uma linhagem celular de EPR imortalizada comercialmente disponível (ARPE-19), ela carece de características essenciais de EPR in vivo e não é amplamente aceita em muitas publicações de pesquisa em oftalmologia. Há uma necessidade premente de obter células primárias representativas do EPR a partir de uma fonte mais prontamente disponível e econômica. Este protocolo elucida o isolamento e subcultivo de células primárias de EPR obtidas post-mortem de olhos suínos, que podem ser obtidas localmente de fornecedores comerciais ou acadêmicos. Este protocolo necessita de materiais comuns tipicamente encontrados em laboratórios de cultura de tecidos. O resultado é uma alternativa primária, diferenciada e custo-efetiva para iPSCs, olhos de doadores humanos e células ARPE-19.

Introduction

O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada localizada na retina externa entre a membrana de Bruch e os fotorreceptores1. As células do EPR formam tight junctions com proteínas como a zonula occludens-1 (ZO-1) e possuem um fenótipo distinto, caracterizado por pigmentação e morfologiahexagonal2,3. Essas células contribuem para a barreira hematorretiniana, apoiando a saúde dos fotorreceptores e mantendo a homeostase retiniana 4,5. Além disso, as células do EPR desempenham um papel crítico na visão, absorvendo luz e reci....

Protocol

Os olhos usados neste procedimento são obtidos post-mortem de um açougue local, inspecionado pelo USDA, e nenhum trabalho é realizado usando animais vivos. Após o sacrifício dos animais, passam aproximadamente 2 h antes que os olhos sejam enucleados. Como a deterioração do tecido pode começar a ocorrer, é importante manter os olhos frescos durante o transporte para evitar mais decaimento. Neste procedimento, os olhos são imediatamente colocados em uma geladeira após a enucleação. Em seguida, a bolsa dos olho.......

Representative Results

Usando este procedimento, células primárias do EPR foram isoladas com sucesso de olhos suínos. A Figura 1A mostra as células do EPR 3 dias após o isolamento com pigmentação característica. Após 1 semana de crescimento, as células estavam totalmente confluentes e formavam uma monocamada saudável (Figura 1B). As células foram então transferidas para pastilhas de cultura celular, onde mantiveram sua pigmentação e morfologia (Figu.......

Discussion

Este protocolo descreve como isolar células de EPR de olhos suínos. A pigmentação e a morfologia dos paralelepípedos são observadas em até 7 dias após o isolamento (Figura 1B). Além disso, os dados TEER indicam a formação de tight junction22 e uma monocamada saudável (Figura 5). Esses resultados mostram que as células do EPR isoladas com este método são semelhantes ao EPR humano e podem ser benéficas em modelos de cultura .......

Disclosures

Nenhum.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Farhad Farjood pela ajuda com a cultura e isolamento de células de EPR suíno e a Thomas Harris pela ajuda com MEV. Os autores agradecem o apoio do Microscopy Core Facility da Utah State University para a análise de MEV. A instalação mantém um microscópio eletrônico de varredura adquirido através de uma National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). O financiamento para este estudo foi fornecido por um National Institutes of Health através do Grant 1R15EY028732 (Vargis) e um BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). O financiamento adicional foi fornecido por uma Bolsa de Pesquisa de Graduação ....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glassCellvisP06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%Alfa AesarL13191.30
Cell StrainerFisher Scientific 22-363-548one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mLFisher Scientific 05-539-12
Cooler, 8 LIgloo32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane InsertsFisher Scientific 07-200-154Culture inserts
Cut Resistant GloveDowellife712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, SolutionFisher Scientific SH3026401for ICC dilutions only 
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvateCorning10-013-CV
DNase I from Bovine PancreasSigma AldrichDN25
DPBS/Modified - calcium - magnesiumCytivaSH3002B.02stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER deviceWorld Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free PowderFisher Scientific BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChemFisher Scientific LC146501
Gauze SpongesFisher Scientific 22-415-504One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, InvitrogenThermo ScientificA32728RPE65 secondary antibody
Ice Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)Fisher Scientific R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"Cole-PalmerEW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten CarbideFisher Scientific 50-822-379
LSM-710 Confocal MicroscopeZeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm Corning430167one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste 
Povidone-Iondine Solution, 10%Equate49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), InvitrogenThermo ScientificMA116578RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10Fisher Scientific 22-079-683
Scalpel Handles Style 3Fisher Scientific 50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"Fisher Scientific 50-209-1792
Tissue Culture Incubator37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 WellsVWR10062-892One for eye wash and one for seeding 
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mLFisher Scientific 14-955-111F
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium BicarbonateCorning25053Cl
Tweezers Style 20AFisher Scientific 17-467-231
Tweezers Style 2AFisher Scientific 50-238-47for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PIFisher Scientific 17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, InvitrogenFisher Scientific 33-911-1ZO-1 conjugated primary antibody

References

  1. Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
  2. Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium p....

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