A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Este protocolo descreve o procedimento para obtenção e cultivo de células epiteliais pigmentares primárias da retina (EPR) a partir de olhos suínos de origem local. Essas células servem como uma alternativa de alta qualidade às células-tronco e são adequadas para pesquisas in vitro da retina.
O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada crucial na retina externa responsável pela sustentação dos fotorreceptores. A degeneração do EPR ocorre comumente em doenças marcadas pela perda progressiva da visão, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). A pesquisa sobre DMRI geralmente se baseia em olhos de doadores humanos ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para representar o EPR. No entanto, essas fontes de EPR requerem longos períodos de diferenciação e conhecimentos substanciais para o cultivo. Além disso, algumas instituições de pesquisa, particularmente aquelas em áreas rurais, não têm fácil acesso aos olhos dos doadores. Embora exista uma linhagem celular de EPR imortalizada comercialmente disponível (ARPE-19), ela carece de características essenciais de EPR in vivo e não é amplamente aceita em muitas publicações de pesquisa em oftalmologia. Há uma necessidade premente de obter células primárias representativas do EPR a partir de uma fonte mais prontamente disponível e econômica. Este protocolo elucida o isolamento e subcultivo de células primárias de EPR obtidas post-mortem de olhos suínos, que podem ser obtidas localmente de fornecedores comerciais ou acadêmicos. Este protocolo necessita de materiais comuns tipicamente encontrados em laboratórios de cultura de tecidos. O resultado é uma alternativa primária, diferenciada e custo-efetiva para iPSCs, olhos de doadores humanos e células ARPE-19.
O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada localizada na retina externa entre a membrana de Bruch e os fotorreceptores1. As células do EPR formam tight junctions com proteínas como a zonula occludens-1 (ZO-1) e possuem um fenótipo distinto, caracterizado por pigmentação e morfologiahexagonal2,3. Essas células contribuem para a barreira hematorretiniana, apoiando a saúde dos fotorreceptores e mantendo a homeostase retiniana 4,5. Além disso, as células do EPR desempenham um papel crítico na visão, absorvendo luz e reci....
Os olhos usados neste procedimento são obtidos post-mortem de um açougue local, inspecionado pelo USDA, e nenhum trabalho é realizado usando animais vivos. Após o sacrifício dos animais, passam aproximadamente 2 h antes que os olhos sejam enucleados. Como a deterioração do tecido pode começar a ocorrer, é importante manter os olhos frescos durante o transporte para evitar mais decaimento. Neste procedimento, os olhos são imediatamente colocados em uma geladeira após a enucleação. Em seguida, a bolsa dos olho.......
Usando este procedimento, células primárias do EPR foram isoladas com sucesso de olhos suínos. A Figura 1A mostra as células do EPR 3 dias após o isolamento com pigmentação característica. Após 1 semana de crescimento, as células estavam totalmente confluentes e formavam uma monocamada saudável (Figura 1B). As células foram então transferidas para pastilhas de cultura celular, onde mantiveram sua pigmentação e morfologia (Figu.......
Este protocolo descreve como isolar células de EPR de olhos suínos. A pigmentação e a morfologia dos paralelepípedos são observadas em até 7 dias após o isolamento (Figura 1B). Além disso, os dados TEER indicam a formação de tight junction22 e uma monocamada saudável (Figura 5). Esses resultados mostram que as células do EPR isoladas com este método são semelhantes ao EPR humano e podem ser benéficas em modelos de cultura .......
Os autores gostariam de agradecer a Farhad Farjood pela ajuda com a cultura e isolamento de células de EPR suíno e a Thomas Harris pela ajuda com MEV. Os autores agradecem o apoio do Microscopy Core Facility da Utah State University para a análise de MEV. A instalação mantém um microscópio eletrônico de varredura adquirido através de uma National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). O financiamento para este estudo foi fornecido por um National Institutes of Health através do Grant 1R15EY028732 (Vargis) e um BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). O financiamento adicional foi fornecido por uma Bolsa de Pesquisa de Graduação ....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
Biosafety Cabinet | |||
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
Centrifuge | |||
Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
Deionized Water | |||
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
Flashlight | |||
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
Ice | Crushed prefered | ||
Inverted Phase Contrast Microscope | |||
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
Vacuum Aspiration System | |||
Water Bath, 37 °C | |||
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved