Выделение первичных пигментных эпителиальных клеток сетчатки свиньи для моделирования in vitro

Summary

В этом протоколе описывается процедура получения и культивирования первичных клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз свиней местного происхождения. Эти клетки служат высококачественной альтернативой стволовым клеткам и подходят для исследований сетчатки in vitro .

Abstract

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) является важным монослоем во внешней части сетчатки, отвечающим за поддержку фоторецепторов. Дегенерация РПЭ обычно возникает при заболеваниях, характеризующихся прогрессирующей потерей зрения, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Исследования ВМД часто опираются на донорские глаза человека или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) для представления РПЭ. Однако эти источники РПЭ требуют длительных периодов дифференциации и значительного опыта для культивирования. Кроме того, некоторые научно-исследовательские институты, особенно в сельской местности, не имеют легкого доступа к донорским глазам. Несмотря на то, что существует коммерчески доступная иммортализированная клеточная линия RPE (ARPE-19), она не обладает существенными характеристиками RPE in vivo и не получила широкого распространения во многих научных публикациях по офтальмологии. Существует насущная потребность в получении репрезентативных первичных клеток РПЭ из более доступного и экономически эффективного источника. Этот протокол разъясняет изоляцию и субкультуру первичных клеток РПЭ, полученных посмертно из свиных глаз, которые могут быть получены на месте у коммерческих или академических поставщиков. Для этого протокола требуются обычные материалы, которые обычно встречаются в лабораториях для культивирования тканей. В результате получается первичная, дифференцированная и экономически эффективная альтернатива ИПСК, донорским глазам человека и клеткам ARPE-19.

Introduction

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой монослой, расположенный в наружной части сетчатки между мембраной Бруха и фоторецепторами¹. Клетки RPE образуют плотные соединения с белками, такими как zonula occludens-1 (ZO-1), и обладают характерным фенотипом, характеризующимся пигментацией и гексагональной морфологией ^2,3. Эти клетки вносят свой вклад в гемато-ретинальный барьер, тем самым поддерживая здоровье фоторецепторов и поддерживая гомеостаз сетчатки ^4,5. Кроме того, клетки RPE играют важнейшую роль в зрении, погл....

Protocol

Глаза, используемые в этой процедуре, получены посмертно из местной, проверенной Министерством сельского хозяйства США мясной лавки, и никакая работа не выполняется с использованием живых животных. После того, как животные были принесены в жертву, проходит примерно 2 часа, прежде чем гл.......

Discussion

В этом протоколе описывается, как изолировать клетки RPE от глаз свиньи. Пигментация и морфология булыжника наблюдаются в течение 7 дней после изоляции (рис. 1B). Кроме того, данные TEER указывают на плотное соединение²² и здоровый монослой (рис. 5). ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody