Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этом протоколе описывается процедура получения и культивирования первичных клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз свиней местного происхождения. Эти клетки служат высококачественной альтернативой стволовым клеткам и подходят для исследований сетчатки in vitro .

Abstract

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) является важным монослоем во внешней части сетчатки, отвечающим за поддержку фоторецепторов. Дегенерация РПЭ обычно возникает при заболеваниях, характеризующихся прогрессирующей потерей зрения, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Исследования ВМД часто опираются на донорские глаза человека или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) для представления РПЭ. Однако эти источники РПЭ требуют длительных периодов дифференциации и значительного опыта для культивирования. Кроме того, некоторые научно-исследовательские институты, особенно в сельской местности, не имеют легкого доступа к донорским глазам. Несмотря на то, что существует коммерчески доступная иммортализированная клеточная линия RPE (ARPE-19), она не обладает существенными характеристиками RPE in vivo и не получила широкого распространения во многих научных публикациях по офтальмологии. Существует насущная потребность в получении репрезентативных первичных клеток РПЭ из более доступного и экономически эффективного источника. Этот протокол разъясняет изоляцию и субкультуру первичных клеток РПЭ, полученных посмертно из свиных глаз, которые могут быть получены на месте у коммерческих или академических поставщиков. Для этого протокола требуются обычные материалы, которые обычно встречаются в лабораториях для культивирования тканей. В результате получается первичная, дифференцированная и экономически эффективная альтернатива ИПСК, донорским глазам человека и клеткам ARPE-19.

Introduction

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой монослой, расположенный в наружной части сетчатки между мембраной Бруха и фоторецепторами1. Клетки RPE образуют плотные соединения с белками, такими как zonula occludens-1 (ZO-1), и обладают характерным фенотипом, характеризующимся пигментацией и гексагональной морфологией 2,3. Эти клетки вносят свой вклад в гемато-ретинальный барьер, тем самым поддерживая здоровье фоторецепторов и поддерживая гомеостаз сетчатки 4,5. Кроме того, клетки RPE играют важнейшую роль в зрении, погл....

Protocol

Глаза, используемые в этой процедуре, получены посмертно из местной, проверенной Министерством сельского хозяйства США мясной лавки, и никакая работа не выполняется с использованием живых животных. После того, как животные были принесены в жертву, проходит примерно 2 часа, прежде чем гл.......

Representative Results

С помощью этой процедуры первичные клетки RPE были успешно выделены из глаз свиньи. На рисунке 1А показаны клетки RPE через 3 дня после выделения с характерной пигментацией. Через 1 неделю роста клетки полностью слились и образовали здоровый монослой (рис. 1Б).......

Discussion

В этом протоколе описывается, как изолировать клетки RPE от глаз свиньи. Пигментация и морфология булыжника наблюдаются в течение 7 дней после изоляции (рис. 1B). Кроме того, данные TEER указывают на плотное соединение22 и здоровый монослой (рис. 5). ?.......

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Фархада Фарджуда за помощь в культивировании и выделении клеток RPE свиней и Томаса Харриса за помощь в SEM. Авторы выражают признательность Центру микроскопии Университета штата Юта за поддержку СЭМ-анализа. На объекте установлен сканирующий электронный микроскоп, приобретенный в рамках гранта Национального научного фонда (CMMI-1337932). Финансирование этого исследования было предоставлено Национальными институтами здравоохранения в рамках гранта 1R15EY028732 (Vargis) и гранта BrightFocus Foundation M2019109 (Vargis). Дополнительное финансирование было предоставлено грантом на исследования и творческие возможности для студентов (Weather....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glassCellvisP06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%Alfa AesarL13191.30
Cell StrainerFisher Scientific 22-363-548one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mLFisher Scientific 05-539-12
Cooler, 8 LIgloo32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane InsertsFisher Scientific 07-200-154Culture inserts
Cut Resistant GloveDowellife712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, SolutionFisher Scientific SH3026401for ICC dilutions only 
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvateCorning10-013-CV
DNase I from Bovine PancreasSigma AldrichDN25
DPBS/Modified - calcium - magnesiumCytivaSH3002B.02stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER deviceWorld Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free PowderFisher Scientific BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChemFisher Scientific LC146501
Gauze SpongesFisher Scientific 22-415-504One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, InvitrogenThermo ScientificA32728RPE65 secondary antibody
Ice Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)Fisher Scientific R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"Cole-PalmerEW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten CarbideFisher Scientific 50-822-379
LSM-710 Confocal MicroscopeZeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm Corning430167one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste 
Povidone-Iondine Solution, 10%Equate49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), InvitrogenThermo ScientificMA116578RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10Fisher Scientific 22-079-683
Scalpel Handles Style 3Fisher Scientific 50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"Fisher Scientific 50-209-1792
Tissue Culture Incubator37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 WellsVWR10062-892One for eye wash and one for seeding 
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mLFisher Scientific 14-955-111F
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium BicarbonateCorning25053Cl
Tweezers Style 20AFisher Scientific 17-467-231
Tweezers Style 2AFisher Scientific 50-238-47for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PIFisher Scientific 17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, InvitrogenFisher Scientific 33-911-1ZO-1 conjugated primary antibody

References

  1. Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
  2. Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium p....

Explore More Articles

207

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved