הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

Summary

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

Abstract

הדמיה של חלבונים בתאים חיים באמצעות GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) ותגים פלואורסצנטיים אחרים שיפרה מאוד את ההבנה של לוקליזציה של חלבונים, דינמיקה ותפקוד. בהשוואה לאימונופלואורסנציה, הדמיה חיה משקפת בצורה מדויקת יותר לוקליזציה של חלבונים ללא ממצאים פוטנציאליים הנובעים מקיבוע רקמות. חשוב לציין כי הדמיה חיה מאפשרת אפיון כמותי וזמני של רמות החלבונים ולוקליזציה, החיוניים להבנת תהליכים ביולוגיים דינמיים כגון תנועת תאים או חלוקתם. עם זאת, מגבלה עיקרית של גישות תיוג פלואורסצנטי היא הצורך ברמות ביטוי חלבון גבוהות מספיק כדי להשיג הדמיה מוצלחת. כתוצאה מכך, חלבונים פלואורסצנטיים רבים המתויגים אנדוגנית עם רמות ביטוי נמוכות יחסית אינם ניתנים לזיהוי. מצד שני, ביטוי חוץ רחמי באמצעות מקדמי נגיפים יכול לפעמים להוביל לחוסר לוקליזציה של חלבונים או שינויים תפקודיים בהקשרים פיזיולוגיים. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מוצגת גישה המשתמשת בזיהוי חלבון בתיווך נוגדנים רגישים ביותר בעוברים חיים, ולמעשה מבצעת אימונופלואורסצנטיות ללא צורך בקיבוע רקמות. כהוכחה עקרונית, ניתן לדמיין בהצלחה קולטן Notch עם תג GFP אנדוגני שבקושי ניתן לגילוי בעוברים חיים לאחר הזרקת נוגדנים. יתר על כן, גישה זו הותאמה כדי להמחיש שינויים פוסט-תרגומיים (PTM) בעוברים חיים, המאפשרים לזהות שינויים זמניים בדפוסי זרחן טירוזין במהלך אמבריוגנזה מוקדמת ולחשוף תת-אוכלוסייה חדשה של פוספוטירוזין (p-Tyr) מתחת לקרומים אפיים. ניתן לשנות גישה זו כך שתתאים לנוגדנים ספציפיים אחרים לחלבון, ספציפיים לתגים או ספציפיים ל-PTM, ועליה להתאים לאורגניזמים אחרים הניתנים להזרקה או לקווי תאים. פרוטוקול זה פותח אפשרויות חדשות להדמיה חיה של חלבונים בעלי שפע נמוך או PTM שבעבר היה מאתגר לזהות באמצעות שיטות תיוג פלואורסצנטיות מסורתיות.

Introduction

אימונופלואורסנציה היא טכניקת אבן פינה בביולוגיה התאית המודרנית שפותחה במקור על ידי אלברט קונס, המאפשרת זיהוי מולקולות בתאי התא הטבעיים שלהן ואפיון ההרכבים המולקולריים של אברונים תת-תאיים או מכונות¹. יחד עם מניפולציות גנטיות, immunofluorescence מסייע לבסס את הרעיון המקובל כיום כי לוקליזציה של חלבונים חיונית לתפקודו². מלבד נוגדנים ראשוניים ספציפיים וצבעים פלואורסצנטיים בהירים, הצלחתה של טכניקה זו נשענת על תהליך מקדים בשם קיבוע וחדירה, המשמר מורפולוגיות תאיות, משתק אנטיגנים ומגביר את נגישות הנוגדנים למדורים תוך תאיים. באופן בלתי נמנע, תהליך הקיבוע והחדירה יהרוג תאים ויסיים את כל התהליכים הביולוגיים³.....

Protocol

הניסויים נערכו בהתאם להנחיות ולאישור בית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת SUSTech. האורגניזם המשמש הוא Drosophila melanogaster, והגנוטיפים הם Notch-Knockin-GFP (כרומוזום X) ו- Sqh-sqh-GFP (כרומוזום II), המסופקים בנדיבות על ידי מעבדותיהם של ד"ר פרנסואה שוויסגוט (מכון פסטר) וד"ר ג'ניפר זאלן (מכון סלואן קטרינג), בהתאמה. בעוד.......

Discussion

הליך מוצג זה מתאר את השיטה המיוחדת של תיוג פלואורסצנטי עם נוגדנים מותאמים אישית והזרקה לאחר מכן לעוברי דרוזופילה בשלב מוקדם. טכניקה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של חלבונים או שינויים לאחר תרגום הקיימים בכמויות נמוכות ובדרך כלל קשה לצפות בהם באמצעות שיטות תיוג GFP/mCherry קונבנציונליות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt