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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Abstract

A visualização de proteínas em células vivas usando GFP (Green Fluorescent Protein) e outras etiquetas fluorescentes melhorou muito a compreensão da localização, dinâmica e função de proteínas. Em comparação com a imunofluorescência, a imagem viva reflete com mais precisão a localização de proteínas sem potenciais artefatos decorrentes da fixação tecidual. É importante ressaltar que imagens ao vivo permitem a caracterização quantitativa e temporal dos níveis e localização de proteínas, cruciais para a compreensão de processos biológicos dinâmicos, como movimento ou divisão celular. No entanto, uma das principais limitações das abordagens de marcação fluorescente é a necessidade de níveis de expressão proteica suficientemente altos para alcançar uma visualização bem-sucedida. Consequentemente, muitas proteínas fluorescentes marcadas endogenamente com níveis de expressão relativamente baixos não podem ser detectadas. Por outro lado, a expressão ectópica usando promotores virais pode, por vezes, levar à má localização de proteínas ou alterações funcionais em contextos fisiológicos. Para abordar essas limitações, é apresentada uma abordagem que utiliza a detecção de proteínas mediadas por anticorpos altamente sensíveis em embriões vivos, essencialmente realizando imunofluorescência sem a necessidade de fixação tecidual. Como prova de princípio, o receptor Notch marcado com GFP endogenamente que é pouco detectável em embriões vivos pode ser visualizado com sucesso após a injeção de anticorpos. Além disso, essa abordagem foi adaptada para visualizar modificações pós-traducionais (MPTs) em embriões vivos, permitindo a detecção de mudanças temporais nos padrões de fosforilação da tirosina durante o início da embriogênese e revelando uma nova subpopulação de fosfotirosina (p-Tyr) sob membranas apicais. Essa abordagem pode ser modificada para acomodar outros anticorpos específicos para proteínas, específicos para tags ou específicos para PTM e deve ser compatível com outros organismos modelo ou linhagens celulares passíveis de injeção. Este protocolo abre novas possibilidades para imagens ao vivo de proteínas de baixa abundância ou PTMs que anteriormente eram difíceis de detectar usando métodos tradicionais de marcação fluorescente.

Introduction

A imunofluorescência é uma técnica fundamental da biologia celular moderna originalmente desenvolvida por Albert Coons, que permite a detecção de moléculas em seus compartimentos celulares nativos e a caracterização das composições moleculares de organelas ou máquinassubcelulares1. Aliada às manipulações genéticas, a imunofluorescência ajuda a estabelecer o conceito hoje bem aceito de que a localização de proteínas é essencial para sua função2. Além de anticorpos primários específicos e corantes fluorescentes brilhantes, o sucesso dessa técnica depende de um processo preliminar denominado fixação e permeabilização, que p....

Protocol

Os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes e aprovação da Faculdade de Ciências da Vida da Universidade SUSTech. O organismo utilizado é Drosophila melanogaster, e os genótipos são Notch-Knockin-GFP (Cromossomo X) e Sqh-sqh-GFP (Cromossomo II), generosamente fornecidos pelos laboratórios do Dr. François Schweisguth (Instituto Pasteur) e da Dra. Jennifer Zallen (Instituto Sloan Kettering), respectivamente. Embora este protocolo se concentre principalmente em aspectos de marcação de ant.......

Representative Results

Para demonstrar as vantagens do método de injeção de anticorpos sobre imagens ao vivo baseadas em etiquetas fluorescentes ou imunofluorescência, são fornecidos dois estudos de caso que caracterizam a localização dinâmica de um receptor transmembrana de baixa abundância, Notch, e um tipo de modificação pós-traducional chamada fosforilação de tirosina em embriões vivos.

A atividade de sinalização da fossa desempenha um papel importante na determinação do destino celular durant.......

Discussion

Este procedimento apresentado descreve o método especializado de marcação por fluorescência com anticorpos personalizados e subsequente injeção em embriões de Drosophila em estágio inicial. Esta técnica facilita a visualização em tempo real de proteínas ou modificações pós-traducionais que existem em baixas quantidades e são tipicamente difíceis de observar através de métodos convencionais de marcação GFP/mCherry.

Deve-se ter cautela ao estender esse método para .......

Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer à Dra. Jennifer A. Zallen por fornecer a linha Sqh-GFP Drosophila e apoio para o desenvolvimento inicial desta técnica, e ao Dr. François Schweisguth por fornecer a linha Notch-GFP Drosophila . Este trabalho foi apoiado por financiamento da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32270809) para H.H.Yu, generoso apoio financeiro e pessoal da Escola de Ciências da Vida, SUSTech, e financiamento para Y. Yan da Comissão de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen/JCYJ20200109140201722.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSangon Biotech A620014 
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling KitInvitrogen A20185Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological MicroscopeSOPTOPEX20Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
BleachClorox®
Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision InstrumentsTW100F-4
CentrifugeEppendorf5245
Cell StrainerFALCON352350
Desiccation chamber LOCK&LOCKHSM8200320ml
Dissecting MicroscopeMshotMZ62Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided TapeScotch665
Fine Super TweezerVETUSST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: RectanglesFisherbrand12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
ForcepVETUS33A-SA
Halocarbon oil 27Sigma-AldrichH8773-100ML
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898-100ML
HeptaneSigma-AldrichH2198-1LHeptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent TOKAI1-7315-01Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301R
Micropipette pullerWorld Precision InstrumentsPUL-1000Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50.
Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 
Pneumatic picopumpWorld Precision InstrumentsPV 830Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20Santa CruzSC-508
Square petri dishesBiosharpBS-100-SD
GFP nanobodyChromotekgt

References

  1. Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
  2. Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
  3. I....

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