Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол описывает индивидуальную флуоресцентную мечение на основе антител и инъекцию в ранние эмбрионы дрозофилы , чтобы обеспечить живую визуализацию белков с низкой распространенностью или посттрансляционных модификаций, которые трудно обнаружить с помощью традиционных подходов GFP/mCherry-tag.

Abstract

Визуализация белков в живых клетках с помощью GFP (Green Fluorescent Protein) и других флуоресцентных меток значительно улучшила понимание локализации, динамики и функции белков. По сравнению с иммунофлуоресценцией, визуализация в реальном времени более точно отражает локализацию белка без потенциальных артефактов, возникающих в результате фиксации тканей. Важно отметить, что визуализация в реальном времени позволяет количественно и во времени охарактеризовать уровни и локализацию белков, что имеет решающее значение для понимания динамических биологических процессов, таких как движение или деление клеток. Тем не менее, основным ограничением флуоресцентных подходов к мечению является необходимость достаточно высоких уровней экспрессии белка для достижения успешной визуализации. Следовательно, многие эндогенно меченные флуоресцентные белки с относительно низким уровнем экспрессии не могут быть обнаружены. С другой стороны, эктопическая экспрессия с использованием вирусных промоторов иногда может привести к неправильной локализации белка или функциональным изменениям в физиологическом контексте. Для устранения этих ограничений представлен подход, который использует высокочувствительное антитело-опосредованное обнаружение белка у живых эмбрионов, по сути, выполняя иммунофлуоресценцию без необходимости фиксации тканей. В качестве доказательства принципа, эндогенный рецептор Notch, помеченный GFP, который едва обнаруживается в живых эмбрионах, может быть успешно визуализирован после инъекции антител. Кроме того, этот подход был адаптирован для визуализации посттрансляционных модификаций (ПТМ) у живых эмбрионов, что позволило обнаружить временные изменения в паттернах фосфорилирования тирозина во время раннего эмбриогенеза и выявить новую субпопуляцию фосфотирозина (p-Tyr) под апикальными мембранами. Этот подход может быть модифицирован для размещения других белково-специфических, меткоспецифических или PTM-специфических антител и должен быть совместим с другими поддающимися инъекциям модельными организмами или клеточными линиями. Этот протокол открывает новые возможности для визуализации в реальном времени белков с низкой распространенностью или PTM, которые ранее было сложно обнаружить с помощью традиционных методов флуоресцентного мечения.

Introduction

Иммунофлуоресценция является краеугольным камнем современной клеточной биологии, первоначально разработанным Альбертом Кунсом, который позволяет обнаруживать молекулы в их собственных клеточных компартментах и характеризовать молекулярный состав субклеточных органелл илимеханизмов. В сочетании с генетическими манипуляциями иммунофлуоресценция помогает установить общепринятую концепцию о том, что локализация белка имеет важное значение дляего функционирования. Помимо специфических первичных антител и ярких флуоресцентных красителей, успех этого метода основан на предварительном процессе, называемом фиксацией и пермеабилиз....

Protocol

Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями и одобрением Школы наук о жизни Университета SUSTech. Используемый микроорганизм - Drosophila melanogaster, а генотипы - Notch-Knockin-GFP (хромосома X) и Sqh-sqh-GFP (хромосома II), любезно предоставленные лабораториями доктора Франсуа Швайсгута (Инстит.......

Representative Results

Чтобы продемонстрировать преимущества метода введения антител по сравнению с флуоресцентной визуализацией или иммунофлуоресценцией на основе флуоресцентных меток, представлены два тематических исследования, характеризующих динамическую локализацию трансмембранного рецептора с ?.......

Discussion

Данная методика представляет собой специализированный метод флуоресцентного мечения с помощью специальных антител и последующей инъекции эмбрионам дрозофилы на ранних стадиях. Этот метод облегчает визуализацию в режиме реального времени белков или посттрансляционных модифик?.......

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дженнифер А. Заллен (Jennifer A. Zallen) за предоставление линии Sqh-GFP Drosophila и поддержку в первоначальной разработке этой методики, а также д-ра Франсуа Швайсгута (Francois Schweisguth) за предоставление линии Notch-GFP Drosophila . Эта работа была поддержана финансированием со стороны Национального фонда естественных наук Китая (32270809) Х.Х.Ю, щедрой финансовой и кадровой поддержкой со стороны Школы наук о жизни SUSTech и финансированием Y. Yan со стороны Шэньчжэньской комиссии по научно-техническим инновациям/JCYJ20200109140201722.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSangon Biotech A620014 
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling KitInvitrogen A20185Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological MicroscopeSOPTOPEX20Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
BleachClorox®
Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision InstrumentsTW100F-4
CentrifugeEppendorf5245
Cell StrainerFALCON352350
Desiccation chamber LOCK&LOCKHSM8200320ml
Dissecting MicroscopeMshotMZ62Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided TapeScotch665
Fine Super TweezerVETUSST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: RectanglesFisherbrand12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
ForcepVETUS33A-SA
Halocarbon oil 27Sigma-AldrichH8773-100ML
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898-100ML
HeptaneSigma-AldrichH2198-1LHeptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent TOKAI1-7315-01Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301R
Micropipette pullerWorld Precision InstrumentsPUL-1000Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50.
Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 
Pneumatic picopumpWorld Precision InstrumentsPV 830Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20Santa CruzSC-508
Square petri dishesBiosharpBS-100-SD
GFP nanobodyChromotekgt

References

  1. Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
  2. Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
  3. I....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved