Визуализация белков с низкой распространенностью и посттрансляционных модификаций в живых эмбрионах дрозофилы с помощью инъекции флуоресцентных антител

Summary

Этот протокол описывает индивидуальную флуоресцентную мечение на основе антител и инъекцию в ранние эмбрионы дрозофилы , чтобы обеспечить живую визуализацию белков с низкой распространенностью или посттрансляционных модификаций, которые трудно обнаружить с помощью традиционных подходов GFP/mCherry-tag.

Abstract

Визуализация белков в живых клетках с помощью GFP (Green Fluorescent Protein) и других флуоресцентных меток значительно улучшила понимание локализации, динамики и функции белков. По сравнению с иммунофлуоресценцией, визуализация в реальном времени более точно отражает локализацию белка без потенциальных артефактов, возникающих в результате фиксации тканей. Важно отметить, что визуализация в реальном времени позволяет количественно и во времени охарактеризовать уровни и локализацию белков, что имеет решающее значение для понимания динамических биологических процессов, таких как движение или деление клеток. Тем не менее, основным ограничением флуоресцентных подходов к мечению является необходимость достаточно высоких уровней экспрессии белка для достижения успешной визуализации. Следовательно, многие эндогенно меченные флуоресцентные белки с относительно низким уровнем экспрессии не могут быть обнаружены. С другой стороны, эктопическая экспрессия с использованием вирусных промоторов иногда может привести к неправильной локализации белка или функциональным изменениям в физиологическом контексте. Для устранения этих ограничений представлен подход, который использует высокочувствительное антитело-опосредованное обнаружение белка у живых эмбрионов, по сути, выполняя иммунофлуоресценцию без необходимости фиксации тканей. В качестве доказательства принципа, эндогенный рецептор Notch, помеченный GFP, который едва обнаруживается в живых эмбрионах, может быть успешно визуализирован после инъекции антител. Кроме того, этот подход был адаптирован для визуализации посттрансляционных модификаций (ПТМ) у живых эмбрионов, что позволило обнаружить временные изменения в паттернах фосфорилирования тирозина во время раннего эмбриогенеза и выявить новую субпопуляцию фосфотирозина (p-Tyr) под апикальными мембранами. Этот подход может быть модифицирован для размещения других белково-специфических, меткоспецифических или PTM-специфических антител и должен быть совместим с другими поддающимися инъекциям модельными организмами или клеточными линиями. Этот протокол открывает новые возможности для визуализации в реальном времени белков с низкой распространенностью или PTM, которые ранее было сложно обнаружить с помощью традиционных методов флуоресцентного мечения.

Introduction

Иммунофлуоресценция является краеугольным камнем современной клеточной биологии, первоначально разработанным Альбертом Кунсом, который позволяет обнаруживать молекулы в их собственных клеточных компартментах и характеризовать молекулярный состав субклеточных органелл или^{механизмов.} В сочетании с генетическими манипуляциями иммунофлуоресценция помогает установить общепринятую концепцию о том, что локализация белка имеет важное значение для^{его функционирования.} Помимо специфических первичных антител и ярких флуоресцентных красителей, успех этого метода основан на предварительном процессе, называемом фиксацией и пермеабилиз....

Protocol

Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями и одобрением Школы наук о жизни Университета SUSTech. Используемый микроорганизм - Drosophila melanogaster, а генотипы - Notch-Knockin-GFP (хромосома X) и Sqh-sqh-GFP (хромосома II), любезно предоставленные лабораториями доктора Франсуа Швайсгута (Инстит.......

Discussion

Данная методика представляет собой специализированный метод флуоресцентного мечения с помощью специальных антител и последующей инъекции эмбрионам дрозофилы на ранних стадиях. Этот метод облегчает визуализацию в режиме реального времени белков или посттрансляционных модифик?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt