Imunoprecipitação com um gel de afinidade anti-epítopo para estudar interações proteína-proteína

Summary

As interações proteína-proteína são importantes para elucidar a função das proteínas-alvo, e a co-imunoprecipitação (co-IP) pode facilmente confirmar os IBPs. Transfectamos transitoriamente um plasmídeo que codifica uma proteína marcada com epítopo em células HEK-293 e desenvolvemos um método de imunoprecipitação para confirmar facilmente a ligação de duas proteínas-alvo.

Abstract

As interações proteína-proteína (PPIs) desempenham um papel fundamental em fenômenos biológicos, como organização celular, transdução de sinal intracelular e regulação transcricional. Portanto, entender os IBPs é um ponto de partida importante para uma investigação mais aprofundada da função da proteína-alvo. Neste estudo, propomos um método simples para determinar a ligação de duas proteínas-alvo, introduzindo vetores de expressão de mamíferos em células HEK-293 usando o método de polietileminina, lisando as células em tampão de lise de proteína caseiro e puxando para baixo as proteínas-alvo em um gel de afinidade de etiqueta de epítopo. Além disso, o PPI entre as várias proteínas fundidas da etiqueta de epítopo pode ser confirmado usando anticorpos de afinidade contra cada etiqueta em vez do gel de afinidade da etiqueta de epítopo. Este protocolo também pode ser usado para verificar vários PPIs, incluindo extratos nucleares, de outras linhagens celulares. Portanto, pode ser usado como um método básico em uma variedade de experimentos de PPI. As proteínas se degradam por um longo curso de tempo e ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Portanto, a lise celular, a imunoprecipitação e o immunoblotting devem ser realizados da forma mais perfeita possível.

Introduction

As proteínas desempenham um papel importante em todas as funções celulares, incluindo processamento de informações, metabolismo, transporte, tomada de decisão e organização estrutural. As proteínas medeiam suas funções interagindo fisicamente com outras moléculas. As interações proteína-proteína (PPIs) são importantes para mediar as funções celulares, como mediar a transdução de sinal, detectar o ambiente, converter energia em movimento físico, regular a atividade de enzimas metabólicas e de sinalização e manter a organização celular¹. Assim, os IBPs podem ser usados para elucidar funções desconhecidas². Os métodos de de....

Protocol

A Figura 1 apresenta uma visão geral do protocolo.

1. Preparação de soluções e tampões

1. Tampão de lise de proteínas: Prepare o tampão de lise de proteínas seguindo um relatório publicado anteriormente⁷ (Tabela 1).
2. Tampão de lise de proteína + inibidor de protease (PI): Adicione o inibidor de protease (consulte a Tabela de Materiais) ao tampão preparado acima.......

Discussion

Este protocolo é quase como os protocolos relatados anteriormente 5,7,14,15. O ponto importante deste protocolo é que nunca paramos o experimento da etapa de lise celular para a etapa de imunoprecipitação. A degradação da proteína dificulta a detecção de IBP. O curso de tempo prolongado e os ciclos repetidos de congelamento e descongelamento degradam as proteínas. A eletroforese em SD.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH8.0)	Nippon gene	311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL	Biorad	4561034
10x Tris/Glycine/SDS	Biorad	1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep	GE Healthcare	NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey	GE Healthcare	NA934-1ML
Cell Scraper M	Sumitomo Bakelite	MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm	IWAKI	4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Invitrogen	10565042
D-PBS (-)	FUJIFILM Wako	045-29795
Glycerol	FUJIFILM Wako	072-00626
Glycine	FUJIFILM Wako	077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724	Cell Signaling	C29F4
Laemmli Sample buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Biorad	7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels	Biorad	1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma	F3165
NaCl	FUJIFILM Wako	191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16	This paper	N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1	This paper	N/A
pcDNA3.1-vector	This paper	N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride	PSI	24765
Penicillin-streptomycin solution	FUJIFILM Wako	168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	FUJIFILM Wako	168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako	167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs	Cytiva	17061801
Protein LoBind Tubes	eppendorf	30108442
ROTATOR RT-5	TAITEC	RT-5
skim milk	Morinaga	0652842
Stripping Solution	FUJIFILM Wako	193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack	Biorad	1704156B03
Trans-Blot Turbo System	Biorad	N/A
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30910.03
Veriblot	Abcam	ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970	Cell Signaling	4970S