Иммунопреципитация с помощью антиэпитопного геля для изучения белок-белковых взаимодействий

Summary

Белок-белковые взаимодействия важны для выяснения функции белков-мишеней, а ко-иммунопреципитация (co-IP) может легко подтвердить ИПП. Мы временно трансфицировали плазмиду, кодирующую белок, помеченный эпитопом, в клетки HEK-293 и разработали метод иммунопреципитации, чтобы легко подтвердить связывание двух белков-мишеней.

Abstract

Белок-белковые взаимодействия (ИПП) играют ключевую роль в биологических явлениях, таких как клеточная организация, внутриклеточная передача сигналов и регуляция транскрипции. Таким образом, понимание ИПП является важной отправной точкой для дальнейшего исследования функции белка-мишени. В этом исследовании мы предлагаем простой метод определения связывания двух белков-мишеней путем введения экспрессирующих векторов млекопитающих в клетки HEK-293 с помощью метода полиэтиленимина, лизирования клеток в самодельном буфере для лизиса белка и извлечения целевых белков на гель аффинности эпитопной метки. Кроме того, ИПП между различными белками, слитыми с эпитопными метками, может быть подтвержден путем использования аффинных антител против каждой метки вместо аффинного геля эпитопной метки. Этот протокол также может быть использован для проверки различных ИПП, включая ядерные экстракты, из других клеточных линий. Поэтому его можно использовать в качестве основного метода в различных экспериментах с ИПП. Белки разрушаются при длительном протекании времени и повторяющихся циклах замораживания-оттаивания. Поэтому лизис клеток, иммунопреципитация и иммуноблоттинг должны выполняться как можно более плавно.

Introduction

Белки играют важную роль во всех клеточных функциях, включая обработку информации, метаболизм, транспорт, принятие решений и структурную организацию. Белки опосредуют свои функции, физически взаимодействуя с другими молекулами. Белок-белковые взаимодействия (ИПП) важны для опосредования клеточных функций, таких как опосредование передачи сигналов, восприятие окружающей среды, преобразование энергии в физическое движение, регулирование активности метаболических и сигнальных ферментов и поддержание клеточной^{организации.} Таким образом, ИЦП могут быть использованы для выяснения неизвестных функций². Методы выявления ИПП можн....

Protocol

На рисунке 1 представлен обзор протокола.

1. Приготовление растворов и буферов

1. Буфер для лизиса белка: Подготовьте буфер для лизиса белка в соответствии с ранее опубликованным отчетом⁷ (Таблица 1).
2. Буфер для лизиса ?.......

Discussion

Этот протокол почти похож на ранее опубликованные протоколы 5,7,14,15. Важным моментом этого протокола является то, что мы никогда не останавливаем эксперимент от этапа лизиса клетки до этапа иммунопреципитации. Деград?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH8.0)	Nippon gene	311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL	Biorad	4561034
10x Tris/Glycine/SDS	Biorad	1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep	GE Healthcare	NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey	GE Healthcare	NA934-1ML
Cell Scraper M	Sumitomo Bakelite	MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm	IWAKI	4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Invitrogen	10565042
D-PBS (-)	FUJIFILM Wako	045-29795
Glycerol	FUJIFILM Wako	072-00626
Glycine	FUJIFILM Wako	077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724	Cell Signaling	C29F4
Laemmli Sample buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Biorad	7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels	Biorad	1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma	F3165
NaCl	FUJIFILM Wako	191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16	This paper	N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1	This paper	N/A
pcDNA3.1-vector	This paper	N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride	PSI	24765
Penicillin-streptomycin solution	FUJIFILM Wako	168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	FUJIFILM Wako	168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako	167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs	Cytiva	17061801
Protein LoBind Tubes	eppendorf	30108442
ROTATOR RT-5	TAITEC	RT-5
skim milk	Morinaga	0652842
Stripping Solution	FUJIFILM Wako	193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack	Biorad	1704156B03
Trans-Blot Turbo System	Biorad	N/A
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30910.03
Veriblot	Abcam	ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970	Cell Signaling	4970S