Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במאמר זה אנו מתארים כלי מתקדם המיועד לניטור ביוסינתזה של כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של שתילי ארבידופסיס . המתודולוגיה החדשנית מספקת דימות פלואורסצנטי כלורופיל לא פולשני בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.

Abstract

ביוסינתזה של כלורופיל היא סימן ההיכר של דה-אטיולציה, אחד השלבים הדרמטיים ביותר במחזור החיים של הצמח. התהליך המבוקר היטב והדינמי מאוד של ביוסינתזה של כלורופיל מופעל במהלך המעבר מהחושך לאור בצמחים פורחים. ברגע שבו שתילים אטיולטיביים נחשפים לעקבות הראשונים של אור השמש, המרה מהירה (בסדר שניות) של פרוטוכלורופיליד לכלורופיליד מתווכת על ידי קומפלקסים חלבוניים ייחודיים קולטי אור, המובילים באמצעות שלבים מטבוליים הבאים לייצור כלורופיל מתפקד במלואו. טכניקות סטנדרטיות לניתוח תכולת כלורופיל כוללות מיצוי פיגמנטים מרקמות צמחים מנותקות, שאינו חל על חקר תהליכים מהירים כאלה. כדי לחקור קינטיקה של כלורופיל in vivo בדיוק גבוה וברזולוציה מרחבית-זמנית בשעות הראשונות לאחר דה-אטיולציה הנגרמת על ידי אור, פותחו מכשיר ופרוטוקול. כאן, אנו מציגים הליך מפורט המיועד לכימות סטטיסטי חזק של כלורופיל בשלבים המוקדמים של ארבידופסיס דה-אטיולציה.

Introduction

דה-אטיולציה מייצגת את השלב הדרמטי ביותר במחזור החיים של הצמח, המאופיין במספר שינויים מורפולוגיים וארגון מחדש מלא של חילוף החומרים של הצמח (מהטרו-טרופי לאוטו-טרופי)1. ביוסינתזה של כלורופיל היא סימן היכר של דה-אטיולציה הנגרמת על ידי אור בצמחים ותהליך דינמי מאוד. היווצרות כלורופיל מקודמן פרוטוכלורופיליד המיוצר בייצור כהה חייבת להיות מתואמת היטב כדי למנוע נזק כתוצאה מתוצרי לוואי תגובתיים2. ההפחתה של פרוטוכלורופיליד לכלורופיליד מזרזת על ידי פרוטוכלורופיליד אוקסידורדוקטאז (PORs) תלויי אור, אנזימים ייחודיים המופעלים ישירות על ידי אור. התגובה מהירה מאוד, מתרחשת בסדר גודל של ms עד s3, מה שמוביל להצטברות כל....

Protocol

1. הכנה בינונית

  1. הכינו את מדיום הגידול על ידי ערבוב 0.75 גרם של חומר ג'לינג עם 50 מ"ל של מים סטריליים נטולי יונים, בבקבוק זכוכית כדי להשיג ריכוז של 1.5% (w/v) עבור צלחת פטרי אחת (120 x 120 x 17 מ"מ). נערו בעדינות את התערובת ולאחר מכן חממו אותה במיקרוגל עד לרתיחה כדי להמיס את חומר הג'לינג (התמיסה ?.......

Representative Results

התפוקה האופיינית המתקבלת באמצעות ההליך החדש שפותח בשתילי Arabidopsis בני 4 ימים ללא אטיולציה של סוג בר (WT), אקוטיפ קולומביה-0 (Col-0) מוצגת באיור 3. בתנאי בקרה (מדיה של טרשת נפוצה בתוספת DMSO), העקומה הביוסינתטית של הכלורופיל מתחילה בפרץ ראשוני של סינתזת הכלורופיל, שבו מאגר הפרוטוכ?.......

Discussion

שלבים קריטיים של הפרוטוקול ופתרון בעיות - אין אור ודואגים למסכה
כפי שמודגש ישירות בתיאור הפרוטוקול לעיל, הימנעות אפילו מכמויות זעירות של אור הן במהלך גידול שתילי צמחים שעברו אטיולציה והן ממש לפני תחילת הפרוטוקול היא בעלת חשיבות קריטית11. במערך שלנו, אנו משתמשים בתא .......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן האירופית לפיתוח אזורי-פרויקט SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). פרויקט זה קיבל מימון באמצעות פרויקט MSCA4Ukraine (ID 1233580), הממומן על ידי האיחוד האירופי. אנו אסירי תודה ללנקה סוצ'ורקובה על העיצוב הגרפי של איור 1.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6-benzylaminopurineDuchefa BiochemieB0904.0001
Aluminum foilMerckZ691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seedsNASC collectionN1092
Cultivation chamberPSIcustom made
DimethilsulfoxidThermo Fisher Scientific042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)MerckEP3123000063
GelriteDuchefa BiochemieG1101
iReenCAM devicePSIcustom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mLMerckZ305170-10EA
Laminar-flow boxUniGreenSchemeITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch3M Science. Applied to Life7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRANDMerckBR780546-500EA
Micropore tape3M Science. Applied to Life7100225115
Osram lumilux green l18w/66Ovalamp200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, ventedMerckZ617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, AxygenMerckAXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer softwarePSIdelivered as a part of the iReenCAM

References

  1. Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. Photomorphogenesis. Arabidopsis Book. 10, e0147 (2012).
  2. Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation.....

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved