A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
במאמר זה אנו מתארים כלי מתקדם המיועד לניטור ביוסינתזה של כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של שתילי ארבידופסיס . המתודולוגיה החדשנית מספקת דימות פלואורסצנטי כלורופיל לא פולשני בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.
ביוסינתזה של כלורופיל היא סימן ההיכר של דה-אטיולציה, אחד השלבים הדרמטיים ביותר במחזור החיים של הצמח. התהליך המבוקר היטב והדינמי מאוד של ביוסינתזה של כלורופיל מופעל במהלך המעבר מהחושך לאור בצמחים פורחים. ברגע שבו שתילים אטיולטיביים נחשפים לעקבות הראשונים של אור השמש, המרה מהירה (בסדר שניות) של פרוטוכלורופיליד לכלורופיליד מתווכת על ידי קומפלקסים חלבוניים ייחודיים קולטי אור, המובילים באמצעות שלבים מטבוליים הבאים לייצור כלורופיל מתפקד במלואו. טכניקות סטנדרטיות לניתוח תכולת כלורופיל כוללות מיצוי פיגמנטים מרקמות צמחים מנותקות, שאינו חל על חקר תהליכים מהירים כאלה. כדי לחקור קינטיקה של כלורופיל in vivo בדיוק גבוה וברזולוציה מרחבית-זמנית בשעות הראשונות לאחר דה-אטיולציה הנגרמת על ידי אור, פותחו מכשיר ופרוטוקול. כאן, אנו מציגים הליך מפורט המיועד לכימות סטטיסטי חזק של כלורופיל בשלבים המוקדמים של ארבידופסיס דה-אטיולציה.
דה-אטיולציה מייצגת את השלב הדרמטי ביותר במחזור החיים של הצמח, המאופיין במספר שינויים מורפולוגיים וארגון מחדש מלא של חילוף החומרים של הצמח (מהטרו-טרופי לאוטו-טרופי)1. ביוסינתזה של כלורופיל היא סימן היכר של דה-אטיולציה הנגרמת על ידי אור בצמחים ותהליך דינמי מאוד. היווצרות כלורופיל מקודמן פרוטוכלורופיליד המיוצר בייצור כהה חייבת להיות מתואמת היטב כדי למנוע נזק כתוצאה מתוצרי לוואי תגובתיים2. ההפחתה של פרוטוכלורופיליד לכלורופיליד מזרזת על ידי פרוטוכלורופיליד אוקסידורדוקטאז (PORs) תלויי אור, אנזימים ייחודיים המופעלים ישירות על ידי אור. התגובה מהירה מאוד, מתרחשת בסדר גודל של ms עד s3, מה שמוביל להצטברות כל....
1. הכנה בינונית
התפוקה האופיינית המתקבלת באמצעות ההליך החדש שפותח בשתילי Arabidopsis בני 4 ימים ללא אטיולציה של סוג בר (WT), אקוטיפ קולומביה-0 (Col-0) מוצגת באיור 3. בתנאי בקרה (מדיה של טרשת נפוצה בתוספת DMSO), העקומה הביוסינתטית של הכלורופיל מתחילה בפרץ ראשוני של סינתזת הכלורופיל, שבו מאגר הפרוטוכ?.......
שלבים קריטיים של הפרוטוקול ופתרון בעיות - אין אור ודואגים למסכה
כפי שמודגש ישירות בתיאור הפרוטוקול לעיל, הימנעות אפילו מכמויות זעירות של אור הן במהלך גידול שתילי צמחים שעברו אטיולציה והן ממש לפני תחילת הפרוטוקול היא בעלת חשיבות קריטית11. במערך שלנו, אנו משתמשים בתא .......
ז.ב. וק.פ. הם עובדי PSI ומרטין טרטילק הוא המנכ"ל והבעלים של חברת PSI המייצרת את iReenCAM. כל המחברים הללו היו מעורבים בפיתוח הכלי כמתואר לעיל7.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן האירופית לפיתוח אזורי-פרויקט SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). פרויקט זה קיבל מימון באמצעות פרויקט MSCA4Ukraine (ID 1233580), הממומן על ידי האיחוד האירופי. אנו אסירי תודה ללנקה סוצ'ורקובה על העיצוב הגרפי של איור 1.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
Cultivation chamber | PSI | custom made | |
Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved