בדיקה לא פולשנית לביוסינתזה של כלורופיל קביעת קינטיקה בשלבים מוקדמים של דה-אטיולציה של ארבידופסיס

Summary

במאמר זה אנו מתארים כלי מתקדם המיועד לניטור ביוסינתזה של כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של שתילי ארבידופסיס . המתודולוגיה החדשנית מספקת דימות פלואורסצנטי כלורופיל לא פולשני בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.

Abstract

ביוסינתזה של כלורופיל היא סימן ההיכר של דה-אטיולציה, אחד השלבים הדרמטיים ביותר במחזור החיים של הצמח. התהליך המבוקר היטב והדינמי מאוד של ביוסינתזה של כלורופיל מופעל במהלך המעבר מהחושך לאור בצמחים פורחים. ברגע שבו שתילים אטיולטיביים נחשפים לעקבות הראשונים של אור השמש, המרה מהירה (בסדר שניות) של פרוטוכלורופיליד לכלורופיליד מתווכת על ידי קומפלקסים חלבוניים ייחודיים קולטי אור, המובילים באמצעות שלבים מטבוליים הבאים לייצור כלורופיל מתפקד במלואו. טכניקות סטנדרטיות לניתוח תכולת כלורופיל כוללות מיצוי פיגמנטים מרקמות צמחים מנותקות, שאינו חל על חקר תהליכים מהירים כאלה. כדי לחקור קינטיקה של כלורופיל in vivo בדיוק גבוה וברזולוציה מרחבית-זמנית בשעות הראשונות לאחר דה-אטיולציה הנגרמת על ידי אור, פותחו מכשיר ופרוטוקול. כאן, אנו מציגים הליך מפורט המיועד לכימות סטטיסטי חזק של כלורופיל בשלבים המוקדמים של ארבידופסיס דה-אטיולציה.

Introduction

דה-אטיולציה מייצגת את השלב הדרמטי ביותר במחזור החיים של הצמח, המאופיין במספר שינויים מורפולוגיים וארגון מחדש מלא של חילוף החומרים של הצמח (מהטרו-טרופי לאוטו-טרופי)¹. ביוסינתזה של כלורופיל היא סימן היכר של דה-אטיולציה הנגרמת על ידי אור בצמחים ותהליך דינמי מאוד. היווצרות כלורופיל מקודמן פרוטוכלורופיליד המיוצר בייצור כהה חייבת להיות מתואמת היטב כדי למנוע נזק כתוצאה מתוצרי לוואי תגובתיים². ההפחתה של פרוטוכלורופיליד לכלורופיליד מזרזת על ידי פרוטוכלורופיליד אוקסידורדוקטאז (PORs) תלויי אור, אנזימים ייחודיים המופעלים ישירות על ידי אור. התגובה מהירה מאוד, מתרחשת בסדר גודל של ms עד s³, מה שמוביל להצטברות כל....

Protocol

1. הכנה בינונית

1. הכינו את מדיום הגידול על ידי ערבוב 0.75 גרם של חומר ג'לינג עם 50 מ"ל של מים סטריליים נטולי יונים, בבקבוק זכוכית כדי להשיג ריכוז של 1.5% (w/v) עבור צלחת פטרי אחת (120 x 120 x 17 מ"מ). נערו בעדינות את התערובת ולאחר מכן חממו אותה במיקרוגל עד לרתיחה כדי להמיס את חומר הג'לינג (התמיסה ?.......

Discussion

שלבים קריטיים של הפרוטוקול ופתרון בעיות - אין אור ודואגים למסכה
כפי שמודגש ישירות בתיאור הפרוטוקול לעיל, הימנעות אפילו מכמויות זעירות של אור הן במהלך גידול שתילי צמחים שעברו אטיולציה והן ממש לפני תחילת הפרוטוקול היא בעלת חשיבות קריטית¹¹. במערך שלנו, אנו משתמשים בתא .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM