Test non invasivo per la determinazione della cinetica della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi della deeziolazione dell'Arabidopsis

Summary

In questo articolo, descriviamo uno strumento avanzato progettato per il monitoraggio della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi di de-eziolamento delle piantine di Arabidopsis . La nuova metodologia fornisce immagini non invasive in tempo reale della fluorescenza della clorofilla ad alta risoluzione spaziale e temporale.

Abstract

La biosintesi della clorofilla è un segno distintivo della deeziolazione, una delle fasi più drammatiche del ciclo di vita delle piante. Il processo strettamente controllato e altamente dinamico della biosintesi della clorofilla viene innescato durante il passaggio dal buio alla luce nelle piante da fiore. Nel momento in cui le piantine eziolate sono esposte alle prime tracce di luce solare, la rapida (in ordine di secondi) conversione della protoclorofilla in clorofilla è mediata da complessi proteici unici che accettano la luce, portando attraverso le successive fasi metaboliche alla produzione di clorofilla completamente funzionale. Le tecniche standard per l'analisi del contenuto di clorofilla includono l'estrazione di pigmenti da tessuti vegetali distaccati, che non si applica allo studio di processi così veloci. Per studiare la cinetica della clorofilla in vivo con elevata precisione e risoluzione spazio-temporale nelle prime ore dopo la de-eziolazione indotta dalla luce, sono stati sviluppati uno strumento e un protocollo. Qui, presentiamo una procedura dettagliata progettata per una quantificazione statisticamente robusta della clorofilla nelle prime fasi della deeziolazione di Arabidopsis .

Introduction

La deeziolazione rappresenta la fase più drammatica del ciclo vitale della pianta, caratterizzata da una serie di cambiamenti morfologici e da un completo riarrangiamento del metabolismo della pianta (da etero- ad auto-tropico)¹. La biosintesi della clorofilla è un segno distintivo della deeziolazione indotta dalla luce nelle piante e un processo molto dinamico. La formazione di clorofilla dai precursori protoclorofillidi prodotti dall'oscurità deve essere strettamente coordinata per evitare danni dovuti a sottoprodotti reattivi². La riduzione della protoclorofillide a clorofillide è catalizzata dalle protoclorofillide o....

Protocol

1. Preparazione media

1. Preparare il terreno di coltura mescolando 0,75 g di gelificante con 50 ml di acqua deionizzata sterile in un flacone di vetro per ottenere una concentrazione dell'1,5% (p/v) per una piastra di Petri (120 x 120 x 17 mm). Agitare delicatamente la miscela e poi riscaldarla nel microonde fino all'ebollizione per sciogliere il gelificante (la soluzione diventa limpida).
2. Lasciare raffreddare il terreno a 58-60 °C prima di procedere ai passaggi successivi. Tutte le fa.......

Discussion

Passaggi critici del protocollo e risoluzione dei problemi: nessuna luce e prendersi cura della maschera
Come evidenziato direttamente nella descrizione del protocollo di cui sopra, è di fondamentale importanza evitare anche le tracce di luce sia durante la coltivazione delle piantine di piante eziolate che appena prima di iniziare il protocollo¹¹. Nella nostra configurazione, utilizziamo una camera oscura dedicata situata nel fitotrone walk-in e separata dal resto del fitotro.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM