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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

In questo articolo, descriviamo uno strumento avanzato progettato per il monitoraggio della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi di de-eziolamento delle piantine di Arabidopsis . La nuova metodologia fornisce immagini non invasive in tempo reale della fluorescenza della clorofilla ad alta risoluzione spaziale e temporale.

Abstract

La biosintesi della clorofilla è un segno distintivo della deeziolazione, una delle fasi più drammatiche del ciclo di vita delle piante. Il processo strettamente controllato e altamente dinamico della biosintesi della clorofilla viene innescato durante il passaggio dal buio alla luce nelle piante da fiore. Nel momento in cui le piantine eziolate sono esposte alle prime tracce di luce solare, la rapida (in ordine di secondi) conversione della protoclorofilla in clorofilla è mediata da complessi proteici unici che accettano la luce, portando attraverso le successive fasi metaboliche alla produzione di clorofilla completamente funzionale. Le tecniche standard per l'analisi del contenuto di clorofilla includono l'estrazione di pigmenti da tessuti vegetali distaccati, che non si applica allo studio di processi così veloci. Per studiare la cinetica della clorofilla in vivo con elevata precisione e risoluzione spazio-temporale nelle prime ore dopo la de-eziolazione indotta dalla luce, sono stati sviluppati uno strumento e un protocollo. Qui, presentiamo una procedura dettagliata progettata per una quantificazione statisticamente robusta della clorofilla nelle prime fasi della deeziolazione di Arabidopsis .

Introduction

La deeziolazione rappresenta la fase più drammatica del ciclo vitale della pianta, caratterizzata da una serie di cambiamenti morfologici e da un completo riarrangiamento del metabolismo della pianta (da etero- ad auto-tropico)1. La biosintesi della clorofilla è un segno distintivo della deeziolazione indotta dalla luce nelle piante e un processo molto dinamico. La formazione di clorofilla dai precursori protoclorofillidi prodotti dall'oscurità deve essere strettamente coordinata per evitare danni dovuti a sottoprodotti reattivi2. La riduzione della protoclorofillide a clorofillide è catalizzata dalle protoclorofillide o....

Protocol

1. Preparazione media

  1. Preparare il terreno di coltura mescolando 0,75 g di gelificante con 50 ml di acqua deionizzata sterile in un flacone di vetro per ottenere una concentrazione dell'1,5% (p/v) per una piastra di Petri (120 x 120 x 17 mm). Agitare delicatamente la miscela e poi riscaldarla nel microonde fino all'ebollizione per sciogliere il gelificante (la soluzione diventa limpida).
  2. Lasciare raffreddare il terreno a 58-60 °C prima di procedere ai passaggi successivi. Tutte le fa.......

Representative Results

L'output tipico ottenuto utilizzando la procedura di nuova concezione nelle piantine di Arabidopsis deeziolate di 4 giorni di vita di tipo selvatico (WT), ecotipo Columbia-0 (Col-0) è mostrato nella Figura 3. In condizioni di controllo (terreni MS integrati con DMSO), la curva biosintetica della clorofilla inizia con un primo burst della sintesi clorofilliana, in cui il pool di protoclorofillidi sintetizzato durante la fase scotomorfogenica della crescita, viene rapidamente convert.......

Discussion

Passaggi critici del protocollo e risoluzione dei problemi: nessuna luce e prendersi cura della maschera
Come evidenziato direttamente nella descrizione del protocollo di cui sopra, è di fondamentale importanza evitare anche le tracce di luce sia durante la coltivazione delle piantine di piante eziolate che appena prima di iniziare il protocollo11. Nella nostra configurazione, utilizziamo una camera oscura dedicata situata nel fitotrone walk-in e separata dal resto del fitotro.......

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Europeo di Sviluppo Regionale-Progetto SINGING PLANT (n. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Questo progetto è stato finanziato attraverso il progetto MSCA4Ukraine (ID 1233580), finanziato dall'Unione Europea. Siamo grati a Lenka Sochurkova per il design grafico della Figura 1.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6-benzylaminopurineDuchefa BiochemieB0904.0001
Aluminum foilMerckZ691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seedsNASC collectionN1092
Cultivation chamberPSIcustom made
DimethilsulfoxidThermo Fisher Scientific042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)MerckEP3123000063
GelriteDuchefa BiochemieG1101
iReenCAM devicePSIcustom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mLMerckZ305170-10EA
Laminar-flow boxUniGreenSchemeITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch3M Science. Applied to Life7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRANDMerckBR780546-500EA
Micropore tape3M Science. Applied to Life7100225115
Osram lumilux green l18w/66Ovalamp200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, ventedMerckZ617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, AxygenMerckAXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer softwarePSIdelivered as a part of the iReenCAM

References

  1. Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. Photomorphogenesis. Arabidopsis Book. 10, e0147 (2012).
  2. Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation.....

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BiologiaNumero 203

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