Este trabalho foi financiado pelo California Sea Grant Kelp Recovery Research Program R/HCE-17 para JBL e MESB, um prêmio de estágio de pesquisa da National Science Foundation DGE-1735040 para PDD, The Nature Conservancy, Schmidt Marine Technology Partners, Sustainable Ocean Alliance, Tinker Foundation para AP-L e The Climate Science Alliance Baja Working Group para RBL e JL. Agradecemos a Steven Allison, Cascade Sorte, Samantha Cunningham, Sam Weber e Caitlin Yee da Universidade da Califórnia, Irvine; Mark Carr, Peter Raimondi, Sarah Eminhizer, Anne Kapuscinski da Universidade da Califórnia, Santa Cruz; Walter Heady e Norah Eddy na The Nature Conservancy; Filipe Alberto e Gabriel Montecinos, da Universidade de Wisconsin, Milwaukee; Jose Antonio Zertuche-González, Alejandra Ferreira-Arrieta e Liliana Ferreira-Arrieta na Universidad Autónoma de Baja California; Luis Malpica-Cruz, Alicia Abadía-Cardoso e Daniel Díaz-Guzmán, do MexCal; os mergulhadores MexCalitos Alejandra Reyes, Monica Peralta, Teresa Tavera, Julia Navarrete, Ainoa Vilalta, Jeremie Bauer e Alfonso Ferreira; e Nancy Caruso pela assessoria técnica. Agradecemos ao Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California por fornecer instalações usadas para desenvolver o sistema de banho-maria. Agradecemos a Ira Spitzer pelo conteúdo de vídeo subaquático e de drones.

Os autores não têm nada a revelar.

As mudanças climáticas antropogênicas são uma ameaça crescente à saúde dos oceanos no mundo 44,45,46,47,48, resultando em grandes perturbações e perda de biodiversidade 49,50,51,52. Para acelerar a restauração de ecossistemas degradados, as Nações Unidas declararam de 2021 a 2030 a "Década das Nações Unidas sobre a Restauração de Ecossistemas", coincidindo com a "Década das Nações Unidas da Ciência Oceânica para o Desenvolvimento Sustentável", que visa reverter a deterioração da saúde dos oceanos53. Em linha com este apelo global à ação, a Kelp Forest Alliance lançou o Kelp Forest Challenge para restaurar 1 milhão de hectares e proteger 3 milhões de hectares de florestas de algas até o ano de 204054. A restauração marinha é subvalorizada55, e os ecossistemas de algas recebem consideravelmente menos atenção do que habitats como recifes de coral, florestas de mangue e prados de ervas marinhas56. A restauração de ecossistemas degradados tem se mostrado eficaz na reconstrução de ecossistemas marinhos, mas pode custar, em média, entre US$ 80.000 e US$ 1.600.000 por hectare, com custos totais médios provavelmente duas a quatro vezes maiores57. As perdas atuais e projetadas exigem o desenvolvimento de metodologias escaláveis, viáveis e econômicas de restauração de algas marinhas como intervenções urgentes de conservação.
Os esforços atuais de restauração de algas usam uma combinação de metodologias para abordar fatores específicos de perda de algas, incluindo transplante de algas adultas, semeadura direta de zoósporos e/ou gametófitos, controle de pastejo e instalação de recifes artificiais11. No entanto, esses métodos exigem recursos substanciais e têm escalabilidade limitada. O transplante típico de algas adultas requer a trabalhosa implantação de materiais ou estruturas artificiais nos bentos, por mergulhadores. Intervenções bottom-up para restabelecer recifes rochosos costeiros, como o controle de competidores e pastadores, também são restringidas pelos custos de mão de obra, pois dependem da remoção subaquática manual ou exclusão desses estressores bióticos11. A técnica de "cascalho verde" supera essas limitações com a implantação simples a partir da superfície, não exigindo instalação subaquática ou conhecimento técnico e escalabilidade a custos relativamente baixos28. Essa abordagem inovadora fornece uma ferramenta de restauração promissora, incentivando testes extensivos em diversos locais e ambientes para desbloquear todo o seu potencial32.
Embora esforços bem-sucedidos de restauração com "cascalho verde" tenham sido documentados em fiordes abrigados na Noruega usando a alga açucareira, Saccharina latissima26, esta técnica ainda está em fase piloto para Macrocystis pyrifera no Pacífico Oriental. Ensaios adicionais são necessários para abordar a sobrevivência esperada de plantas externas de M. pyrifera dentro de sua área de distribuição. Em condições de exposição à onda típicas do crescimento de M. pyrifera , cascalhos menores podem ser mais propensos ao movimento e à abrasão, levando a plantas externas danificadas. Além disso, a flutuabilidade positiva proporcionada por pneumatocistos de M. pyrifera preenchidos com gás pode levar a que as plantas de cascalho verde sejam efetivamente levadas para longe do local de restauração e, portanto, o tamanho e o peso da brita são fatores importantes a serem explorados para esta espécie. Em um estudo piloto recente (maio de 2022; Ensenada, Baja California, México), foi observado sucesso preliminar no campo com M. pyrifera , indicado pela fixação de hapteros ao substrato circundante e crescimento de juvenis que atingiram 1,2 m de comprimento após dois meses no campo (Figura 4). Isso demonstra uma oportunidade clara que ainda precisa ser explorada na utilização de "cascalho verde" para M. pyrifera no Pacífico Oriental. Este vídeo mostra a técnica de "cascalho verde" com M. pyrifera e é um recurso valioso que simplifica e centraliza as práticas existentes na fase de cultivo da restauração para apoiar estudos que abordam sucessos e limitações em diferentes configurações de campo.
Com a técnica de "cascalho verde", muitas unidades de cascalho menores e individuais podem ser semeadas em uma escala que pode aumentar a probabilidade de sucesso em comparação com abordagens de transplante mais comuns com plantas adultas. No entanto, o principal aspecto escalável desta técnica é a sua simples implantação a partir da superfície, o que pode facilitar a restauração de grandes áreas por barco. Para ambientes de campo onde a implantação de cascalho pequeno não é adequada, este protocolo pode ser adaptado para transplantar M. pyrifera em uma ampla gama de substratos, incluindo cascalho maior ou mesmo pedregulhos pequenos, corda que pode ser amarrada a âncoras subaquáticas naturais ou implantadas, ou telhas que podem ser aparafusadas ou coladas usando epóxi marinho no fundo do mar em condições mais expostas. Essas adaptações de implantação não alterarão as instalações necessárias para o cultivo de M. pyrifera , mas aumentarão subsequentemente o custo de implantação.
As perturbações antropogénicas e as alterações climáticas estão actualmente a superar a capacidade de adaptação das populações naturais. Isso coloca desafios significativos aos esforços tradicionais de conservação que restauram os ecossistemas aos seus estados históricos 58,59,60,61,62,63. Assim, os marcos conservacionistas têm se expandido para incluir o manejo antecipatório considerando resiliência e capacidade adaptativa64. O manejo antecipatório para enfrentar as mudanças climáticas está sendo implementado para espécies arbóreas em ecossistemas florestais65 e tem sido proposto para esforços adicionais de restauração para aumentar o potencial evolutivo dos plantõesexternos 66,67. Embora essas estratégias sejam inerentemente mais fáceis de manipular em ambientes terrestres, vários estudos estão começando a explorar sua aplicação em ambientes marinhos 62,68,69,70. Por exemplo, os recifes de coral estão ameaçados por numerosos estressores antropogênicos que resultaram em declínios sem precedentes71,72. Em resposta às perdas dessas importantes espécies de fundação, técnicas de restauração ativa e adaptação assistida são cada vez mais defendidas para conservar os recifes de corais remanescentes e suas funções associadas 62,73,74. Uma técnica envolve a translocação de indivíduos dentro de sua faixa de distribuição atual para aumentar a tolerância ao estresse térmico75. Em relação à restauração de algas formadoras de dossel, a brita verde possui uma estrutura personalizável para explorar técnicas de adaptação assistida, como translocação de genótipos resilientes para áreas vulneráveis, manipulação não genética, como hibridização, ou aclimatização de indivíduos ao estresse ambiental62, com resultados que visam à obtenção de linhagens mais resistentes para programas de restauração76,77.
Aproveitar o apoio local para melhorar os esforços de restauração é crucial para sustentar o sucesso da conservação do ecossistema de algas. O envolvimento das partes interessadas locais pode aumentar a adesão local às necessidades de restauração 6,50 e promover a gestão costeira que poderia subsequentemente resultar em maior financiamento e longevidade da proteção do ecossistema de algas. Tal como acontece com todas as outras metodologias de restauração de algas, estruturas estruturadas de tomada de decisão que integram diversos objetivos ecológicos, socioeconômicos e de conservação ajudarão a alcançar resultados ótimos para os ecossistemas de algas e as comunidades que eles apoiam11.

As algas formadoras de dossel (macroalgas marrons da ordem Laminariales) são espécies de fundação de importância global, dominando recifes rochosos costeiros em mares temperados e árticos1. Essas algas formam habitats biogênicos estruturalmente complexos e altamente produtivos, conhecidos como florestas de algas marinhas, que suportam comunidades marinhas taxonomicamentediversas2. As florestas de algas marinhas em todo o mundo fornecem muitos serviços ecossistêmicos aos seres humanos, incluindo produção de pesca comercial, ciclagem de carbono e nutrientes e oportunidades recreativas, com um valor total estimado de US$ 500 bilhões por ano3.
Apesar de seu valor substancial, as florestas de algas marinhas enfrentam crescentes pressões antrópicas em muitas regiões3. As mudanças climáticas representam uma das ameaças mais significativas às algas marinhas devido ao aquecimento dos oceanos a longo prazo, combinado com o aumento da frequência de anomalias de temperatura 3,4,5,6,7. O aumento da temperatura oceânica está associado à limitação de nutrientes8, enquanto a exposição ao estresse térmico acima dos limiares fisiológicos pode resultar em mortalidade9. Em combinação com estressores locais regionais variáveis7, as populações de algas marinhas estão globalmente declinando em aproximadamente 2% ao ano10 com perdas significativas e deslocamentos persistentes para estados comunitários alternados em certas regiões 6,11,12,13,14. A recuperação natural das populações de algas marinhas por si só pode não ser suficiente para reverter a extensão das perdas atuais e projetadas 15,16,17,18, ressaltando a importância da restauração ativa.
Os esforços atuais de restauração de algas marinhas podem usar uma combinação de metodologias para restabelecer essas importantes espécies de fundação em recifes rochosos costeiros 3,19. As metodologias escolhidas para abordar preocupações específicas do local dependem do contexto geográfico, dos impedimentos específicos para a recuperação de algas marinhas e do contexto socioecológico11. Compreender as conexões e a interdependência dos sistemas socioecológicos é a chave, e intervenções que envolvam instituições locais e angariem apoio das comunidades locais aumentam a probabilidade de esforços bem-sucedidos de restauração20.
Além das mudanças climáticas, a pressão dos herbívoros ou a competição interespecífica impulsiona, diminui ou suprime a recuperação (por exemplo, por ouriços-do-mar13, peixes herbívoros 21,22, algas de grama 9,23 ou algas invasoras24). A restauração pode se concentrar na remoção desses estressores bióticos25, embora esses métodos exijam recursos substanciais e manutenção contínua11. Para catalisar a recuperação de espécies de algas, tem havido esforços para uma abordagem de semeadura direta, por exemplo, pesando sacos de malha preenchidos com lâminas férteis de algas até os bentos que liberam zoósporos no ambiente26. Este método, no entanto, é demorado e requer instalação e remoção subaquática técnica. Outros casos concentram-se no transplante de grandes quantidades de plantas doadoras adultas inteiras, que podem comprometer populações de doadores intimamente associadas e vulneráveis e muitas vezes são limitadas a pequenas escalas devido à dependência do transplante contínuo27.
Para regiões onde a limitação de esporos de algas marinhas pode estar impedindo a recuperação de florestas de algas devido à fragmentação de habitat, uma abordagem relativamente nova de restauração de algas marinhas chamada técnica de "cascalho verde" foi introduzida. A técnica foi testada com sucesso na Estação de Pesquisa de Flødevigen, no sul da Noruega28 e representou uma opção promissora para restauração devido ao custo-efetividade e escalabilidade. O fluxo de trabalho dessa técnica é o seguinte: (1) uma solução de esporos é criada a partir de tecido fértil coletado de algas adultas reprodutivas no campo e, em seguida, semeado em pequenos substratos, como cascalho; (2) algas em estágio inicial são criadas em condições abióticas controladas em laboratório sobre substratos; (3) substratos com esporófitos visíveis são implantados no campo em recifes específicos como "cascalho verde", onde os esporófitos continuam a crescer. Note-se que os esforços típicos de transplante de indivíduos adultos requerem instalação subaquática trabalhosa e inibidora de custos por mergulhadores, e a técnica de "cascalho verde" utiliza implantação simples a partir da superfície28.
A técnica de "cascalho verde" está atualmente sendo testada por membros de vários grupos de trabalho internacionais29 em diferentes ambientes e várias espécies de algas laminarianas. Este protocolo descreve as instalações, materiais e métodos necessários para a coleta de tecidos, esporulação, semeadura, condições de criação, manutenção regular e monitoramento de algas em estágio inicial antes da implantação desta técnica de restauração no campo usando a alga gigante, Macrocystis pyrifera. Este protocolo é um recurso valioso para pesquisadores, gestores e partes interessadas que buscam fornecer informações sobre os sucessos e limitações deste método com M. pyrifera em diferentes cenários de campo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Natural seawater sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottles</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07J6JP4D1</td>
			<td>Natural seawater sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m filters (water + air)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01M1VWUWL</td>
			<td>Natural seawater sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#39;&#39; PVC 90-Degree Elbow</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>203812125</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m filters</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00D04BG56</td>
			<td>Natural seawater sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;m filters</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B082WS9NPH</td>
			<td>Natural seawater sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x5mm tubing</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0852HXPN6</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x4&#39;&#39; Sterile Gauze</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07NDK8XM3</td>
			<td>Sporulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x6mm tubing</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08BCRV1FY</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#181;m filters</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B082WS9NPH</td>
			<td>Natural seawater sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL falcon tubing</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01M04HGPJ</td>
			<td>Sporulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8x10mm tubing</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01MSM3LLZ</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air filters</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MTGR85010</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07XWD9WWC</td>
			<td>Sporulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate ACS reagent, 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215406-100G</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium Grade Gravel</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07XRCKFBJ</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-100MG</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid, 99.8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61.83, 500g</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5090113707</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium D-Pantothenate,ge98.0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Pantothenic Acid Calcium Salt, P0012-25G 1/EA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P001225G</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valves</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08HRZR4MM</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear tubing 3/8&#39;&#39; - 10 ft</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07MTYMW13</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G, WARNING - California - Cancer Hazard, 93-2749-100G 1/EA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5090114752</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound microscope with camera</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>M83EZ-C50S</td>
			<td>Monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>07-250-080</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture light</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07RRRPJ63</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture stoppers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07DX6J7QD</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drainage connector</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00GUZ6CV0</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA CAS Number: 6381-92-6 Molecular Formula: C10H14N2O8Na2- 2H2O Molecular Weight: 372.2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50213299</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduations: 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.10 mL, 0.17 mL, 0.25 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S81273</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduations: 1.0 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.25 mL, 0.50 mL, 1.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S81275</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eisco Safety Pack Volumetric Flask Sets - Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Closure Material: Glass, Closure Size: Stopper Number: 9, 9, 13, Closure Type: Penny Stopper, Graduated: Ye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S81271</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07LCKBKCT</td>
			<td>Natural seawater sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Graduated Cylinders, Capacity: 500 mL, Graduations: 5 mL, Borosilicate Glass, Autoclavable: Yes, Limit of Error: +/-4.0 mL, Recommended Applications: Education, Subdivision: 5 mL, S63460 1/EA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S63460</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXACAM C1 Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>FLEXACAM C1</td>
			<td>Monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid, C19H19N7O6, CAS Number59303, vitamin m, pteroylglutamic acid, vitamin b9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, folic acid, folate, 25g, 100781, CHEBI:27470, Yellow to Orange, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AAJ6083314</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Standing 20 Gallon Utility Sink</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B094TLH19L</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GERMANIUM DIOXIDE 99.99 10GR</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC190000100</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Graduated Cylinders, Class A Round Base, Eisco, For Use With: Measuring liquids, Capacity: 1000 mL, Graduations: 10 mL White, CH0344OWT 1/EA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S88442</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00L1S93PS</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol phosphate disodium salt hydrate isomeric mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6501-100G</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth containers -3.4 Qt- 3.25 Lt transparent containers with transparent lid</td>
			<td>Container store</td>
			<td>#10014828</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth light</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B086R14MFW</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07TJQDKLJ</td>
			<td>Sporulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 99.5% (titration)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hinged plastic jars</td>
			<td>SKS Bottle &#38; Packaging</td>
			<td>40280125.01S</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol research grade, USP/NF For bacteriology. Optically inactive. Tested for its suitability in tissue culture. Size - 100G Storage Conditions - +15 C TO +30 C Catalog Number - 26310.01 CAS 87-89-8</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50247745</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean - 50 G</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000255NKA</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope Leica DMi1</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1</td>
			<td>Monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate ACS reagent, 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>236489-100G</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Licor Ligth Meter Data Logger</td>
			<td>Licor</td>
			<td>LI-250A</td>
			<td>Monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/temperature HOBO data logger</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B075X2SWKN</td>
			<td>Monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lights 150W</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0799DQM9V</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate meets USP testing specifications</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8179-100G</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium size rocks 2-3 inch, 20 pounds</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>206823930</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic Acid, 99%, C6H5NO2, CAS Number59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carboxypyridine, niacin, 3pyridinecarboxylic acid, nicotinic acid, pellagrin, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 deg.C (559 deg.F), 123.11,</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AAA1268330</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Aminobenzoic acid 99.82% 4-aminobenzoic acid, C7H7NO2, CAS Number: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ICN10256925</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCV cement</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B001D9WRWG</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic water valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0006JLVE4</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic water valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07G5FY7X1</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale 1mg</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DTH95FN</td>
			<td>Materials to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump for filtered air</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0BG2BT9RX</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing 1x24&#39;&#39;</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>202300505</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Light meter</td>
			<td>Apogee Instruments</td>
			<td>MQ-510</td>
			<td>Monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-103-1566</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Grommets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07YZD22ZP</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salinity refractometer</td>
			<td>ATC</td>
			<td>B018LRO1SU</td>
			<td>Monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shade mesh 6x50 ft</td>
			<td>Home depot</td>
			<td>316308418</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ge 99.0% Nitric Acid, Sodium Salt, NNaO3, CAS Number: 7631-99-4, 500g, 1/EA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP360500</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering for aeration opening</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08R3515SF</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray isporopyl alcohol</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>&#8206; B08LW5P844</td>
			<td>Sporulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sissors</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07BT4YLHT</td>
			<td>Sporulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tray</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08CV33YXG</td>
			<td>Sporulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel twizzers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01JTZTAJS</td>
			<td>Sporulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bars</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07C4TNKXB</td>
			<td>Materials to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submersible circulation pump 400 GPH</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07RZKRM13</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submersible Spherical Quantum Sensor</td>
			<td>Waltz</td>
			<td>US-SQS/L</td>
			<td>Monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature gun</td>
			<td>Infrared Thermometer 749</td>
			<td>B07VTPJXH9</td>
			<td>Monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270-25G</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymine 99% 2, 4-Dihydroxy-5-methylpyrimidine, C5H6N2O2, CAS Number: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC157850250</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Acrylic sheet 24x48 inch</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>202038048</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing water circulation 1&#39;&#39;x10 ft</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07ZC1PSF3</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light for natural seawater sterilization</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B018OI7PYS</td>
			<td>Natural seawater sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacum pump</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B087XBTPVW</td>
			<td>Natural seawater sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629-100MG</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S89446</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 500 mL, CH0446HWT 1/EA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S89445</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Chiller 200-600GPM</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07BHHP71C</td>
			<td>Option 2 - Medium scale - Water bath systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-splitters for 4x6mm tubing</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08XTJKFCH</td>
			<td>Option 1 Small scale - Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0251-100G</td>
			<td>Chemicals to create Provasoli&#8217;s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

field collection and laboratory maintenance of canopy-forming giant kelp to facilitate restoration

As algas formadoras de dossel são espécies fundamentais essenciais, apoiando a biodiversidade e fornecendo serviços ecossistêmicos avaliados em mais de US$ 500 bilhões anuais. O declínio global das florestas de algas gigantes devido a estressores ecológicos impulsionados pelo clima ressalta a necessidade de estratégias inovadoras de restauração. Uma técnica de restauração emergente conhecida como "cascalho verde" visa semear algas jovens em grandes áreas sem trabalho subaquático extensivo e representa uma ferramenta de restauração promissora devido à relação custo-benefício e escalabilidade. Este artigo em vídeo ilustra um protocolo e ferramentas para o cultivo de algas gigantes, Macrocystis pyrifera. Também fornece um recurso para estudos futuros para abordar os sucessos e limitações desse método em ambientes de campo. Descrevemos métodos de campo e de laboratório para coletar tecidos reprodutivos, esporular, inocular, criar, manter e monitorar substratos semeados com estágios iniciais de vida usando a técnica de cascalho verde. O protocolo simplifica e centraliza as práticas atuais de restauração neste campo para apoiar pesquisadores, gestores e partes interessadas no cumprimento dos objetivos de conservação de algas.

A técnica de restauração de cascalho verde ainda está em fase piloto, com dados limitados de sobrevivência de plantões para outras espécies28, e ainda não há dados publicados para Macrocystis pyrifera. Usando a coleta de campo e a manutenção laboratorial descritas neste protocolo, testamos a significância das condições de criação sítio-específicas para duas populações distintas de algas doadoras antes da hipotética implantação de "cascalho verde" (Figura 5). O tecido reprodutivo das algas marinhas foi coletado na Califórnia (EUA) de populações K1 mais frias (Santa Cruz 36,60167°N, 121,88508°W) e K4 mais quentes (San Diego, 32,85036°N, -117,27600°W) e criadas em duas temperaturas: (1) 12 °C (temperatura padrão de cultivo para aquicultura de algas marinhas e TSM média de inverno para K1) e (2) 20 °C (TSM média de verão para K4, e uma onda de calor de 4 °C para K1). Todas as lâminas de vidro utilizadas para monitorar o desenvolvimento do estágio de vida das algas foram marcadas com uma grade padronizada, e imagens de alta resolução foram capturadas usando essa grade como referência para permitir a observação de campos fixos ao longo do tempo usando um microscópio invertido e uma câmera (N = 5 imagens por amostra, 2,479 mm x 1,859 mm).
Após 24 dias após a esporulação, os gametófitos foram contados a partir de imagens de microscópio (N = 300 imagens de 60 amostras). Para testar diferenças na contagem de gametófitos, modelos lineares generalizados de efeitos mistos foram empregados com distribuição de Poisson usando a função glmmTMB() no pacote glmmTMB41, e comparações pareadas foram realizadas com emtrends() do pacote emmeans42em R. Nossos resultados ilustram que a resposta dos gametófitos à variabilidade térmica foi diferente entre as populações K1 e K4 (t = 2,7, p = 0,007), onde a temperatura não teve efeito para a população K4 mais quente (estimativa = -0,01, erro padrão [EP] = 0,01, intervalo de confiança [IC] = [-0,03, 0,01]), mas teve efeito para a população K1 mais fria (estimativa = -0,06, SE = 0,02, IC = [-0,10, -0,03]) (Figura 6A), sugerindo uma possível divergência adaptativa nas características de tolerância térmica. Os gametófitos de Kelp são frequentemente descritos como um estágio de resistência43, o que significa que eles produzem um fenótipo para todos os fins que é tolerante ao estresse e relativamente insensível à variabilidade ambiental. No entanto, esses resultados indicam que a variabilidade térmica impõe uma pressão significativa nessa fase inicial.
Após 32 dias após a esporulação, esporófitos visíveis com comprimentos superiores a aproximadamente 1 mm foram contados na totalidade de cada lâmina de vidro de 2,5 cm por 7,5 cm (N = 72 amostras totais). Para testar diferenças na contagem de esporófitos visíveis, modelos lineares generalizados de efeitos mistos foram empregados com distribuição de Poisson usando a função glmmTMB() no pacote glmmTMB e comparações pareadas foram realizadas com emtrends() de emmeans de pacote em R. Nossos resultados ilustram que a resposta dos esporófitos à variabilidade térmica é semelhante entre populações diferenciadas K1 e K4 (z = 0,92, p = 0,36), onde a temperatura teve efeito para a população K4 mais quente (estimativa = -0,66, SE = 0,04, IC = [-0,74, - 0,57]), bem como para a população K1 mais fria (estimativa = -0,85, SE = 0,13, IC = [-1,10, -0,60]) (Figura 6B). As amostras criadas a 20 °C cresceram poucos esporófitos visíveis (média ± SE = 0,4 ± 0,2) em comparação com aquelas criadas a 12 °C (média ± EP = 82,4 ± 9,8). Este resultado sugere que a produção de esporófitos é mais sensível à temperatura do que o estádio gametófito, e que as temperaturas de cultivo sítio-específicas não devem exceder 15 °C para alcançar o desenvolvimento esporófito, conforme descrito no protocolo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama do sistema de incubadora de cascalho verde . (A) Fonte de luz vermelha para culturas de gametófitos de volume vegetativo. (B) Porta de acesso para fios elétricos e tubulações, levando a uma tomada externa. (C) Estrutura para bloquear a luz de espectro total da seção de luz vermelha. (D) Uma seção de cultivo de "cascalho verde". (E) fontes luminosas de espectro total. (F) Linhas de tubulação conectadas a uma fonte de ar filtrada externa. (G) Válvulas de retenção para reduzir a contaminação transportada pelo ar. (H) Recipientes de cultura individuais que minimizam a contaminação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig02.jpg"> Figura 2: Diagrama do sistema de banho-maria de cascalho verde . (A) Chiller com bomba submersa (em I). (B) Banheira de 20 litros para banho-maria. (C) Dreno para recirculação em banho-maria. (D) Válvula para recirculação de banho-maria. (E) Fonte de luz. F) Recipiente de 2,5 L «cascalho verde» com tampa transparente e abertura de aeração. (G) Fonte de aeração. (H) Tubulações que recirculam água com uso de bombas submersas. (I) Receptor de banho-maria de/para chiller de/para banheiras com bombas submersíveis. (J) Cobertura de acrílico para minimizar a evaporação em banho-maria. (K) Sombra de malha para ajustar a intensidade da luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig03v2.jpg"> Figura 3: Desenvolvimento de Macrocystis pyrifera . Estágios da história de vida de desenvolvimento de Macrocystis pyrifera a partir de ensaios de crescimento em laboratório. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig04.jpg"> Figura 4: Cascalho verde semeado com Macrocystis pyrifera. ' Cascalho verde' semeado com Macrocystis pyrifera é cultivado em laboratório até que os esporófitos atinjam 1-2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig05.jpg"> Figura 5: Séries temporais experimentais. Imagens de exemplo de uma série temporal que acompanha o crescimento e desenvolvimento experimental de gametófitos e esporófitos de Macrocystis pyrifera originários de duas populações coletadas na Califórnia (EUA) e cultivadas em duas temperaturas diferentes. K1 = Santa Cruz, K4 = San Diego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig06.jpg"> Figura 6: Resultados representativos. Estágios de vida de Macrocystis pyrifera observados para populações de origem K1 Santa Cruz San Diego K4 Santa Cruz cultivadas em condições térmicas constantes de 12 e 20 °C. Barras de erro, média ± 1 EP. Asterisk (*) denota diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05). (A) Gametófitos aos 24 dias (N = 300 imagens totais de 60 amostras). (B) Esporófitos visíveis aos 32 dias (N = 72 amostras, dentro de uma área padronizada de 2,5 cm por 7,5 cm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/Supplemental%20File_Calendar%20R2.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo descreve a coleta em campo e a manutenção laboratorial regular de substratos semeados com algas gigantes formadoras de dossel para uso em ensaios de restauração para abordar o sucesso e as limitações da técnica de brita verde em ambientes de campo.

Coleta de campo e manutenção laboratorial de algas gigantes formadoras de dossel para facilitar a restauração

Canopy-forming kelps are essential foundation species, supporting biodiversity and providing ecosystem services valued at more than USD$500 billion ...

As florestas de algas marinhas estão enfrentando perdas sem precedentes devido a estressores ambientais impulsionados pelo clima e mudanças na dinâmica trófica. Este vídeo ilustra um protocolo e ferramentas para o cultivo de algas gigantes, Macrocystis pyrifera, usando a técnica de cascalho verde, e fornece um recurso valioso para ensaios posteriores para abordar os sucessos e limitações deste método em diferentes cenários. As instalações de cultivo de algas devem ser capazes de controlar temperaturas que variam entre 10 e 15 graus Celsius, fornecer luz de espectro completo variando entre zero e 180 fótons micromoles por metro de segundo quadrado e aeração filtrada.Os sistemas de incubadora com uma tomada embutida ou uma porta de acesso para fios e tubulações podem ser adaptados com luzes e uma fonte de ar. Se um sistema de incubadora não estiver dentro do escopo, orçamento ou escala pretendida do projeto, banhos de água temperados por água do mar natural fria ou um chiller podem ser usados. As temperaturas de criação são específicas do local e da estação.Coloque um termômetro em meio de crescimento ou use uma pistola de temperatura para garantir que a temperatura esteja entre 10 e 18 graus Celsius. Defina as luzes de espectro total para uma luz de 12 horas, período de foto escuro de 12 horas usando as configurações de tempo na fonte de luz ou conectando a fonte de luz a um temporizador com um ciclo programável. Meça a intensidade da luz com um medidor quântico PAR abaixo da superfície perto da brita e ajuste usando uma fonte de luz regulável, ou sobrepondo a malha sobre a fonte de luz.A aeração é adicionada às culturas com o uso de bombas de ar. Utilize filtros com tamanho de poro de 02 micrômetros para reduzir a contaminação bacteriana transportada pelo ar. Materiais e estações devem ser esterilizados e preparados com antecedência.Consulte o texto para obter detalhes. A brita usada para semeadura deve ter uma superfície texturizada ou ligeiramente esburacada, uma vez que os gametófitos são mais propensos a serem retidos em substratos com alta rugosidade. Esfregue e enxágue a brita até que a água fique clara para remover qualquer poeira, ou detritos.Mergulhe a brita em uma solução de água sanitária diluída a 10% por pelo menos 24 horas e enxágue com água do mar esterilizada por filtro. Calcule o volume de água do mar esterilizada por filtro necessário para atualizar os recipientes de cultura a cada semana e programe essa tarefa de filtragem e esterilização de acordo. Grandes lotes de água do mar esterilizada por filtro podem ser armazenados em recipientes escuros por até seis meses a oito a 10 graus Celsius.Se a refrigeração não estiver disponível, guarde em uma área escura e fria. Filtre a água usando um sistema de filtragem a vácuo com um tamanho de poro de 55 a um micrômetro. Desligue a fonte de vácuo antes que toda a água seja puxada para evitar danificar o filtro e despeje a água filtrada em um recipiente estéril dedicado.Para volumes maiores, um sistema de filtragem de fluxo pode ser usado. Por exemplo, passe a água do mar através de uma série de três filtros plissados, 10 micrômetros, cinco micrômetros e um micrômetro, dispostos do maior para o menor tamanho de poros. Este sistema de fluxo é conectado a uma luz UV de aquário.Esterilizar água do mar filtrada usando métodos UV e/ou autoclavagem. O enriquecimento da água do mar esterilizada por filtro com nutrientes e vitaminas é fundamental para o crescimento de algas. As opções comuns de enriquecimento incluem meios de água do mar enriquecidos com Provasoli e meios F/2.Consulte o texto para obter detalhes. Obter as autorizações necessárias para a coleta de tecidos de algas que atendam às leis e regulamentos locais. Por meio do mergulho, selecionar de três a cinco lâminas de esporofilos de 10 a 15 indivíduos férteis de Macrocystis pyrifera com soros visíveis espaçados de dois a cinco metros entre si.Selecione esporofilos limpos e intactos, se possível, com pouca ou nenhuma incrustação ou degradação. Armazenar lâminas de esporofilo separadamente de acordo com o indivíduo pai a partir deste ponto. Os esporófilos crescem em uma saia densa na base acima do porão da alga adulta, e podem ser identificados por sua falta de pneumatocistos cheios de gás.Transporte as lâminas de esporofila em sacos coletores escuros para evitar a exposição excessiva à luz solar preenchidos minimamente com água do mar do local para manter as lâminas molhadas e armazenadas em caixas térmicas a aproximadamente 12 graus Celsius até a chegada ao espaço de cultivo. Certifique-se de que as amostras não estão em contato direto com o gelo. Os esporofos podem ser enviados para, ou de outros locais.Enxaguar esporofilos com água do mar esterilizada filtrada. Embrulho de lâminas coletadas de um único indivíduo de Macrocystis pyrifera em papel toalha úmido embebido em água do mar esterilizada filtrada e novamente em papel alumínio para evitar penetração de luz e dessecação adicional. Este método de armazenamento é comumente conhecido como o método burrito.Coloque essas embalagens em um refrigerador com gelo com uma barreira protetora, como plástico bolha reciclado ou papelão. Prepare o refrigerador para o envio durante a noite e certifique-se de que alguém esteja disponível para receber a remessa e coloque os pacotes em condições refrigeradas. Opcionalmente, armazenar esporofilos por 12 a 48 horas em condições refrigeradas, o que favorece a liberação de esporos do tecido sorus.Para armazenar, use o método burrito. Se opcionalmente armazenado, encontrar evidências de esporulação parcial nas toalhas de papel indicando a presença de tecido sórus fértil. O tecido sórus é frequentemente ligeiramente elevado e de cor mais escura do que o tecido circundante.Selecione o tecido sórus maduro e corte em cortes quadrados de 25 centímetros usando tesouras estéreis. Selecione de uma a duas seções de sori limpas de 10 a 15 pais individuais de algas para promover a diversidade genética. Para limpar, esfregue suavemente ambos os lados do tecido sórus em uma direção apenas com uma gaze estéril umedecida com água do mar esterilizada por filtro.Se necessário, raspe o tecido sórus suavemente com uma lâmina de barbear estéril. Submergir a seção de soros em um banho de água doce por 30 segundos a um minuto e enxaguar com água do mar esterilizada por filtro. Submerja cada seção de sori em água do mar esterilizada por filtro temperada a 10 a 15 graus Celsius dentro de um tubo Falcon estéril de 50 mililitros.Alternativamente, as seções de sori podem esporular em um único recipiente estéril. Coloque os tubos a quatro a 12 graus Celsius no escuro para esporular por no máximo quatro horas. Se não houver geladeira disponível, guarde em uma área fria e com pouca luz.Usando um microscópio composto e hemocitômetro, observar a densidade de esporos de três a quatro amostras a cada 30 minutos até quatro horas. Altere as pontas da pipeta entre as amostras. Se as densidades forem de pelo menos 10.000 esporos por mililitro, passe para a próxima etapa.Se uma secção de soros não produzir esporos após quatro horas, elimine a amostra. Os esporos podem se instalar dentro de horas após a liberação, mas podem ser observados nadando em um movimento circular. Remova cada uma das seções sori de seus tubos Falcon.Combine as soluções de esporos resultantes em um único recipiente esterilizado e quantifique a densidade final combinada. Calcular o volume final de solução de esporos necessário para a inoculação para uma concentração final de 500 a 1.000 esporos por mililitro em recipientes de cultura. Consulte o texto para obter detalhes.Coloque lâminas de vidro estéreis dentro de recipientes de cultura para monitorar o desenvolvimento de algas. Inclua pelo menos 30 lâminas distribuídas aleatoriamente em recipientes de cultura para monitoramento suficiente. Inocular o volume calculado de solução de esporos no recipiente de cultura usando uma ponta de pipeta estéril que contém substratos submersos em meios de crescimento.Feche o recipiente e mexa suavemente para distribuir os esporos. Coloque o recipiente em seu sistema de cultura. Defina sua temperatura entre 10 e 15 graus Celsius com base na temperatura em seu local de implantação.As luzes de espectro completo para plantas aquáticas são ajustadas para um ciclo de luz de 12 horas, 12 horas de escuro com intensidades de luz que variam entre zero a 180 fótons micromoles por metro de segundo quadrado. Consulte o texto para obter uma linha do tempo de condições de luz específicas. Após um dia, forneça aeração leve com uma fonte de ar filtrada.Monitore pelo menos duas lâminas de vidro aleatórias diariamente, ou a cada dois dias nas duas primeiras semanas para avaliar o desenvolvimento. Após duas semanas, monitorar pelo menos duas lâminas de vidro aleatórias uma a duas vezes por semana quanto ao crescimento saudável e contaminação até que os esporófitos atinjam um a dois centímetros de tamanho. Para monitorar, manuseie a lâmina com uma pinça esterilizada e coloque em uma placa de Petri limpa contendo água do mar esterilizada suficiente para submergir a lâmina de vidro.Não devolva as lâminas de vidro às culturas após a remoção para evitar contaminação cruzada. Use um composto, ou microscópio invertido em uma ampliação de 40 a 400x para observar algas em estágio inicial. Espera-se que o desenvolvimento acompanhe a seguinte linha do tempo.Esporos sedimentados são observados de zero a um dia. Os esporos podem germinar dentro de algumas horas demonstrada pela formação de um tubo germinativo. A germinação é tipicamente observada em um a dois dias.Os gametófitos iniciais são tipicamente observados em um a quatro dias. A gametogênese, processo pelo qual as células sofrem divisão e diferenciação para formar gametas masculinos e femininos, é tipicamente observada nas primeiras duas semanas. As células femininas são cinco a sete vezes maiores que as masculinas.Os gametófitos masculinos crescem ramos filamentosos finos, enquanto as fêmeas são mais redondas ou ovais. As fêmeas normalmente produzem ovos dentro de duas a três semanas. Os espermatozoides liberados dos machos fertilizam os óvulos, que se desenvolvem em esporófitos embrionários.As esporófitas são tipicamente observadas dentro de duas a quatro semanas. O zigoto sofre rápida divisão celular, resultando no crescimento de lâminas de um a dois centímetros dentro de aproximadamente seis a oito semanas. Toda semana, mude os meios de crescimento para repor os nutrientes e minerais necessários para o crescimento de Macrocystis pyrifera.Resfriar os meios de crescimento frescos até a temperatura adequada. Certifique-se de que os meios de crescimento não excedam 15 graus Celsius durante este processo. Sifão de meios para fora de seus recipientes de cultivo para evitar a perturbação de substratos semeados.Deixe a mídia escorrer até que o recipiente esteja quase vazio. Atualize a mídia imediatamente para minimizar a dessecação. Incline ligeiramente os recipientes de crescimento ao reencher, de modo que o meio percorra a lateral do recipiente de cultura para perturbar minimamente os substratos.Reorganize aleatoriamente as posições do recipiente ou da cuba durante as mudanças semanais de mídia para levar em conta as diferenças na irradiância da luz. Veja o texto para um calendário para acompanhar as atividades e expectativas para as culturas de Macrocystis. Ele indica o tempo de ajustes de luz e aeração, bem como mudanças semanais de mídia.Após seis a oito semanas de cultivo em laboratório, os esporófitos juvenis estão com um a dois centímetros de comprimento e prontos para implantação. Atualize a mídia de crescimento em contêineres de cultura 24 horas antes da implantação. Obter as licenças necessárias para implantação de cascalho que atendam às leis e regulamentos locais.Transporte cascalho verde por até seis horas em um refrigerador sombreado. A implantação deve ser cronometrada para evitar a luz solar mais direta. Utilize uma estrutura sombreada no barco para evitar o sol direto durante o processo de implantação.Espalhe cuidadosamente o cascalho verde da superfície para o recife abaixo, ou através de mergulho ao testar em novos locais e em pequenas escalas. A técnica de restauração de cascalho verde ainda está em fase acadêmica com dados limitados de sobrevivência de plantas externas para outras espécies e ainda sem dados para Macrocystis pyrifera. No entanto, o sucesso no campo foi observado em um estudo piloto recente, indicado pela fixação de hapteros ao substrato circundante e algas juvenis crescendo até 1,2 metros após dois meses no campo.Usando a coleta de campo e manutenção laboratorial descritas neste protocolo, cultivamos duas populações distintas de algas doadoras a 12 graus Celsius e 20 graus Celsius para elucidar efeitos dependentes da temperatura no desenvolvimento de microestágios de Macrocystis pyrifera ao longo do tempo. Após 24 dias, gametófitos foram contados a partir de imagens de microscópio. A temperatura teve efeito para a população K1 mais fria, mas não para a população K4, sugerindo uma possível divergência adaptativa nas características de tolerância térmica.Isso destaca a importância das temperaturas de criação específicas do local. Após 32 dias, esporófitos visíveis foram contados em cada lâmina de vidro. A temperatura teve efeito semelhante para as populações K1 e K4.As amostras criadas a 20 graus Celsius cresceram poucos esporófitos visíveis em comparação com aquelas criadas a 12 graus Celsius. Este resultado sugere que a produção de esporófitos é mais sensível à temperatura do que a fase gametófita, e que as temperaturas de cultivo não devem exceder 15 graus Celsius para atingir o desenvolvimento dos esporófitos, conforme descrito no protocolo. Com este protocolo visualizado, esperamos encorajar mais testes com o método de cascalho verde para melhorar a restauração de valiosas florestas subaquáticas de algas marinhas por pesquisadores e gestores em todo o mundo.Boa sorte em sua jornada de cascalho verde com Macrocystis pyrifera.

Coleta de campo e manutenção laboratorial de algas gigantes formadoras de dossel para facilitar a restauração

Abstract