A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.
מיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מאוכלוסיות תאים נפרדות, כגון תאי סטרומה מזנכימליים, תאי אנדותל, תאי אוסטאו-שושלת ופיברובלסטים, המספקים תמיכה לתאי גזע המטופויטיים (HSC). בנוסף לתמיכה ב-HSC תקין, מיקרו-סביבה של מח העצם ממלאת גם תפקיד בהתפתחות הפרעות תאי גזע המטופויאטיות, כגון תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS) ולוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מוטציות הקשורות ל- MDS ב- HSCs מובילות לחסימה בהתמיינות ואי ספיקת מח עצם מתקדמת, במיוחד אצל קשישים. MDS יכול לעתים קרובות להתקדם AML עמיד לטיפול, מחלה המאופיינת על ידי הצטברות מהירה של פיצוצים מיאלואידים לא בוגרים. מיקרו-סביבה של מח העצם ידועה כמשתנה בחולים עם גידולים מיאלואידים אלה. כאן מתואר פרוטוקול מקיף לבידוד ואפיון פנוטיפי של תאים מיקרו-סביבתיים של מח עצם ממודלים מורינים של תסמונת מיאלודיספלסטית ולוקמיה מיאלואידית חריפה. בידוד ואפיון שינויים באוכלוסיית נישות מח העצם יכול לסייע בקביעת תפקידם בהתחלת המחלה והתקדמותה, ועשוי להוביל לפיתוח טיפולים חדשניים המתמקדים בשינויים מקדמי סרטן באוכלוסיית סטרומה מח העצם.
המיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מתאים המטופויטיים, תאי סטרומה לא המטופויטיים והמטריצה החוץ תאית 1,2. מיקרו-סביבה זו יכולה לקדם התחדשות עצמית של תאי גזע המטופויטיים, לווסת התמיינות שושלת ולספק תמיכה מבנית ומכנית לרקמת העצם 1,2,3,4,5. נישת הסטרומה כוללת תאי אוסטאו-שושלת, פיברובלסטים, תאי עצב ותאי אנדותל6, בעוד שהנישה ההמטופויטית מורכבת מאוכלוסיות הלימפה והמיאלואידים 1,2,3
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה למשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. עכברים גודלו והוחזקו במתקני הטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר. כדי למדל MDS בסיכון גבוה, נעשה שימוש בדגם NHD13 murine19 הזמין מסחרית. במודל זה, תאי סטרומה של מח עצם מנותחים ?.......
מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לניתוח אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם, כגון תאי אנדותל ותאי סטרומה מזנכימליים, ממודלים של MDS ולוקמיה מורין (איור 1). איור 2 מתאר את אסטרטגיית ה-gating לזיהוי אוכלוסיות מעניינות, החל מבחירת התאים (P1) במקטע המעוכל והמדו.......
מודלים של לוקמיה מורנית שימשו באופן נרחב לזיהוי אותות פנימיים ונישתיים של תאים המקדמים התקדמות לוקמיה מיאלואידית אגרסיבית 6,19,21. כאן מוצג פרוטוקול מקיף מבוסס ציטומטריית זרימה להגדרת ההרכב התאי של מיקרו-סביבה של מח העצם במודלים של MDS ו-AML.
ברצוננו להודות ל-URMC Flow Cytometry Core. עבודה זו נתמכה על ידי פרס האגודה האמריקאית להמטולוגיה, פרס הקרן לחקר לוקמיה ומענקים של NIH R01DK133131 ו-R01CA266617 שהוענקו לג'יי.בי.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Incubator | BINDER | C150-UL | |
Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved