Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.

Abstract

מיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מאוכלוסיות תאים נפרדות, כגון תאי סטרומה מזנכימליים, תאי אנדותל, תאי אוסטאו-שושלת ופיברובלסטים, המספקים תמיכה לתאי גזע המטופויטיים (HSC). בנוסף לתמיכה ב-HSC תקין, מיקרו-סביבה של מח העצם ממלאת גם תפקיד בהתפתחות הפרעות תאי גזע המטופויאטיות, כגון תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS) ולוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מוטציות הקשורות ל- MDS ב- HSCs מובילות לחסימה בהתמיינות ואי ספיקת מח עצם מתקדמת, במיוחד אצל קשישים. MDS יכול לעתים קרובות להתקדם AML עמיד לטיפול, מחלה המאופיינת על ידי הצטברות מהירה של פיצוצים מיאלואידים לא בוגרים. מיקרו-סביבה של מח העצם ידועה כמשתנה בחולים עם גידולים מיאלואידים אלה. כאן מתואר פרוטוקול מקיף לבידוד ואפיון פנוטיפי של תאים מיקרו-סביבתיים של מח עצם ממודלים מורינים של תסמונת מיאלודיספלסטית ולוקמיה מיאלואידית חריפה. בידוד ואפיון שינויים באוכלוסיית נישות מח העצם יכול לסייע בקביעת תפקידם בהתחלת המחלה והתקדמותה, ועשוי להוביל לפיתוח טיפולים חדשניים המתמקדים בשינויים מקדמי סרטן באוכלוסיית סטרומה מח העצם.

Introduction

המיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מתאים המטופויטיים, תאי סטרומה לא המטופויטיים והמטריצה החוץ תאית 1,2. מיקרו-סביבה זו יכולה לקדם התחדשות עצמית של תאי גזע המטופויטיים, לווסת התמיינות שושלת ולספק תמיכה מבנית ומכנית לרקמת העצם 1,2,3,4,5. נישת הסטרומה כוללת תאי אוסטאו-שושלת, פיברובלסטים, תאי עצב ותאי אנדותל6, בעוד שהנישה ההמטופויטית מורכבת מאוכלוסיות הלימפה והמיאלואידים 1,2,3

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה למשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. עכברים גודלו והוחזקו במתקני הטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר. כדי למדל MDS בסיכון גבוה, נעשה שימוש בדגם NHD13 murine19 הזמין מסחרית. במודל זה, תאי סטרומה של מח עצם מנותחים ?.......

Representative Results

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לניתוח אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם, כגון תאי אנדותל ותאי סטרומה מזנכימליים, ממודלים של MDS ולוקמיה מורין (איור 1). איור 2 מתאר את אסטרטגיית ה-gating לזיהוי אוכלוסיות מעניינות, החל מבחירת התאים (P1) במקטע המעוכל והמדו.......

Discussion

מודלים של לוקמיה מורנית שימשו באופן נרחב לזיהוי אותות פנימיים ונישתיים של תאים המקדמים התקדמות לוקמיה מיאלואידית אגרסיבית 6,19,21. כאן מוצג פרוטוקול מקיף מבוסס ציטומטריית זרימה להגדרת ההרכב התאי של מיקרו-סביבה של מח העצם במודלים של MDS ו-AML.

Disclosures

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ל-URMC Flow Cytometry Core. עבודה זו נתמכה על ידי פרס האגודה האמריקאית להמטולוגיה, פרס הקרן לחקר לוקמיה ומענקים של NIH R01DK133131 ו-R01CA266617 שהוענקו לג'יי.בי.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL pipette Tips Genesee Scientific 24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge TubesAVANTL211511-CS
10 µL pipette TipsGenesee Scientific 24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1760
1000 mL Vacuum Filtration FlaskNEST344021
15 mL Centrifuge TubeVWR10026-076
2 mL Aspirating PipetteNEST325011
200 µL pipette TipsGenesee Scientific 24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm styleFalcon352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm styleFalcon352235
50 mL Centrifuge TubeNEST602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation LidFalcon353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture BarrierVWR56616-031
APC MicroBeadsMiltenyi 130-090-855
autoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec GmBH4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences5531410.5 mg/mL 
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA790666.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)Invitrogen404-59810.2 mg/mL
C57BL/6J MiceJackson Laboratory 664
Carbon Dioxide Gas TankAirgasCD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7Invitrogen25-0311-820.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APCInvitrogen17-0451-820.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon Falcon352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mLCole-ParmerEW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138-500MG
Collagenase Type ISTEMCELL7415
Corning Mini CentrifugeCORNING6770
Corning Stripettor Ultra Pipet ControllerCorning4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichD4513
Dispase II, powderGibco117105041
DPBS 10xgibco14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)VWR89125-174
Fine scissors - sharpFine Science Tools14061-10
Foundation B Fetal Bovine SerumGeminiBio900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter KitsFisherScientific F167370G
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10xgibco14185-052
HemocytometerFisher02-671-10
Incubator BINDERC150-UL
KimwipesKIMTECHK222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety CabinetNuaireNU-425-400
LD ColumnsMiltenyi Biotec GmBH130-042-901
LSE Vortex MixerCORNING6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1Becton, Dickinson and Company647800L6
MACS MULTI STAND Miltenyi Biotec GmBH130-042-303
MACsmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmBH130-090-753
mIgGMillipore-Sigma18765-10mg2 mg/mL 
Nup98-HoxD13 (NHD13) MiceJackson Laboratory 010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)Biolegend1041060.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)Biolegend1359200.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco1514012210,000 U/mL
Plastipak 3 mL SyringeBecton, Dickinson and Company309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in WaterThermoFisher ScientificP3566
QuadroMACS  Separator Miltenyi Biotec GmBH130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series CentrifugeThermo Scientific 75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APCInvitrogen17-5921-820.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%Gibco15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen15575-038

References

  1. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  2. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved