Идентификация популяций микроокружения костного мозга при миелодиспластическом синдроме и остром миелоидном лейкозе

Summary

Здесь представлен подробный протокол выделения и характеристики микросредовых популяций костного мозга по мышиным моделям миелодиспластических синдромов и острого миелоидного лейкоза. Этот метод выявляет изменения в некроветворной нише костного мозга, включая эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки, с прогрессированием заболевания.

Abstract

Микроокружение костного мозга состоит из отдельных клеточных популяций, таких как мезенхимальные стромальные клетки, эндотелиальные клетки, клетки остеолинии и фибробласты, которые обеспечивают поддержку гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Помимо поддержания нормальных ГСК, микроокружение костного мозга также играет роль в развитии заболеваний гемопоэтических стволовых клеток, таких как миелодиспластические синдромы (МДС) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). МДС-ассоциированные мутации в ГСК приводят к блокированию дифференцировки и прогрессирующей недостаточности костного мозга, особенно у пожилых людей. МДС часто может прогрессировать до резистентного к терапии ОМЛ, заболевания, характеризующегося быстрым накоплением незрелых миелоидных бластов. Известно, что микроокружение костного мозга изменяется у пациентов с этими миелоидными новообразованиями. В данной работе описан комплексный протокол по выделению и фенотипической характеристике клеток микроокружения костного мозга из мышиных моделей миелодиспластического синдрома и острого миелоидного лейкоза. Выделение и характеристика изменений в популяциях ниши костного мозга может помочь определить их роль в инициации и прогрессировании заболевания и может привести к разработке новых терапевтических средств, нацеленных на способствующие раку изменения в стромальных популяциях костного мозга.

Introduction

Микроокружение костного мозга состоит из гемопоэтических клеток, негемопоэтических стромальных клеток и внеклеточного матрикса ^1,2. Это микроокружение может способствовать самообновлению гемопоэтических стволовых клеток, регулировать дифференцировку линий и обеспечивать структурную и механическую поддержку костной ткани 1,2,3,4,5. Стромальная ниша включает костно-линейные клетки, фибробласты, нервные клетки и эндотелиальные клетки^6....

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по ресурсам животных Университета Рочестера. Мыши были выведены и содержались в учреждениях по уходу за животными в Университете Рочестера. Для моделирования МДС высокого риска использует.......

Discussion

Модели мышиного лейкоза широко использовались для идентификации внутриклеточных и нишевых сигналов, способствующих прогрессированию агрессивного миелоидного лейкоза ^6,19,21. Представлен комплексный протокол на основе проточной цитом.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038