הקמה ואפיון של אורגנואידי קיבה שמקורם במטופל מביופסיות של גוף קיבה שפיר ואפיתל אנטראלי

Summary

אורגנואידים שמקורם בקיבה מוצאים שימוש הולך וגובר במחקר, אך פרוטוקולים רשמיים ליצירת אורגנואידי קיבה אנושיים מתעכלים חד-תאיים עם צפיפות זריעה מתוקננת חסרים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת אורגנואידים בקיבה באופן אמין מרקמת ביופסיה המתקבלת במהלך אנדוסקופיה עליונה.

Abstract

אורגנואידים שמקורם בקיבה (PDOs) מציעים כלי ייחודי לחקר ביולוגיה ופתולוגיה של קיבה. כתוצאה מכך, PDOs אלה מוצאים שימוש הולך וגובר במגוון רחב של יישומי מחקר. עם זאת, קיים מחסור בגישות שפורסמו לייצור PDO בקיבה מתעכלים חד-תאיים תוך שמירה על צפיפות זריעת תאים ראשונית מתוקננת. בפרוטוקול זה, הדגש הוא על התחלת אורגנואידים בקיבה מתאים בודדים מבודדים ומתן שיטה להעברת אורגנואידים באמצעות פיצול. חשוב לציין, הפרוטוקול מראה כי גישה סטנדרטית לצפיפות זריעת התאים הראשונית מניבה באופן עקבי אורגנואידים בקיבה מרקמת ביופסיה שפירה ומאפשרת כימות סטנדרטי של צמיחת אורגנואידים. לבסוף, ראיות תומכות בתצפית החדשנית כי PDO קיבה מציג שיעורים משתנים של היווצרות וגדילה בהתבסס על האם מקורם של האורגנואידים בביופסיות של הגוף או באזורים אנטראליים של הקיבה. באופן ספציפי, מתגלה כי השימוש ברקמת ביופסיה אנטראלית להתחלת אורגנואידים גורם למספר גדול יותר של אורגנואידים שנוצרו ולצמיחת אורגנואידים מהירה יותר על פני תקופה של 20 יום בהשוואה לאורגנואידים שנוצרו מביופסיות של גוף הקיבה. הפרוטוקול המתואר כאן מציע לחוקרים שיטה בזמן וניתנת לשחזור ליצירה מוצלחת ולעבודה עם PDO קיבה.

Introduction

אורגנואידים הם מבנים תאיים זעירים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) הדומים לארכיטקטורה ולפונקציונליות של האיברים שמהם הם נגזרו ^1,2. מודלים אלה שגודלו במעבדה נוצרים על ידי טיפוח תאי גזע או תאים ספציפיים לרקמות בסביבה מבוקרת המאפשרת לתאים אלה להתארגן בעצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים ^1,2,3. אחד היתרונות העיקריים של אורגנואידים הוא יכולתם לשחזר את הביולוגיה האנושית באופן הדוק יותר מאשר תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות (2D) ^1,2,3. בפרט, אורגנו....

Protocol

כל הרקמה האנושית המשמשת בפרוטוקול זה נאספה מאנשים שסיפקו הסכמה מדעת לאיסוף רקמות באמצעות מחקר איסוף רקמות קיבה שאושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת פנסילבניה (IRB #842961). המשתתפים במחקר זה נדרשו לעבור אנדוסקופיה עליונה כחלק מהטיפול השגרתי שלהם, להיות בני 18 לפחות ולהיות מסוגלים לס.......

Discussion

להלן מתואר פרוטוקול מפורט ליצירה אמינה של אורגנואידי קיבה אנושיים מתאים בודדים שבודדו מביופסיות של אפיתל שפיר מגוף הקיבה והאנטרום. השלבים הקריטיים בפרוטוקול סובבים סביב תזמון, כמו גם טיפול במטריצת קרום המרתף. כדי לשמר את הכדאיות, חיוני להתחיל את הפרוטוקול בהקדם האפשרי לאחר רכישת רקמת הב?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503