A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
אורגנואידים שמקורם בקיבה מוצאים שימוש הולך וגובר במחקר, אך פרוטוקולים רשמיים ליצירת אורגנואידי קיבה אנושיים מתעכלים חד-תאיים עם צפיפות זריעה מתוקננת חסרים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת אורגנואידים בקיבה באופן אמין מרקמת ביופסיה המתקבלת במהלך אנדוסקופיה עליונה.
אורגנואידים שמקורם בקיבה (PDOs) מציעים כלי ייחודי לחקר ביולוגיה ופתולוגיה של קיבה. כתוצאה מכך, PDOs אלה מוצאים שימוש הולך וגובר במגוון רחב של יישומי מחקר. עם זאת, קיים מחסור בגישות שפורסמו לייצור PDO בקיבה מתעכלים חד-תאיים תוך שמירה על צפיפות זריעת תאים ראשונית מתוקננת. בפרוטוקול זה, הדגש הוא על התחלת אורגנואידים בקיבה מתאים בודדים מבודדים ומתן שיטה להעברת אורגנואידים באמצעות פיצול. חשוב לציין, הפרוטוקול מראה כי גישה סטנדרטית לצפיפות זריעת התאים הראשונית מניבה באופן עקבי אורגנואידים בקיבה מרקמת ביופסיה שפירה ומאפשרת כימות סטנדרטי של צמיחת אורגנואידים. לבסוף, ראיות תומכות בתצפית החדשנית כי PDO קיבה מציג שיעורים משתנים של היווצרות וגדילה בהתבסס על האם מקורם של האורגנואידים בביופסיות של הגוף או באזורים אנטראליים של הקיבה. באופן ספציפי, מתגלה כי השימוש ברקמת ביופסיה אנטראלית להתחלת אורגנואידים גורם למספר גדול יותר של אורגנואידים שנוצרו ולצמיחת אורגנואידים מהירה יותר על פני תקופה של 20 יום בהשוואה לאורגנואידים שנוצרו מביופסיות של גוף הקיבה. הפרוטוקול המתואר כאן מציע לחוקרים שיטה בזמן וניתנת לשחזור ליצירה מוצלחת ולעבודה עם PDO קיבה.
אורגנואידים הם מבנים תאיים זעירים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) הדומים לארכיטקטורה ולפונקציונליות של האיברים שמהם הם נגזרו 1,2. מודלים אלה שגודלו במעבדה נוצרים על ידי טיפוח תאי גזע או תאים ספציפיים לרקמות בסביבה מבוקרת המאפשרת לתאים אלה להתארגן בעצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים 1,2,3. אחד היתרונות העיקריים של אורגנואידים הוא יכולתם לשחזר את הביולוגיה האנושית באופן הדוק יותר מאשר תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות (2D) 1,2,3. בפרט, אורגנו....
כל הרקמה האנושית המשמשת בפרוטוקול זה נאספה מאנשים שסיפקו הסכמה מדעת לאיסוף רקמות באמצעות מחקר איסוף רקמות קיבה שאושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת פנסילבניה (IRB #842961). המשתתפים במחקר זה נדרשו לעבור אנדוסקופיה עליונה כחלק מהטיפול השגרתי שלהם, להיות בני 18 לפחות ולהיות מסוגלים לס.......
התוצאות המייצגות הבאות נגזרות מביופסיות שנלקחו מהאפיתל השפיר של גוף הקיבה ואזורי אנטרום קיבה בקיבתם של חמישה חולים שונים שעברו אנדוסקופיה עליונה. שתיים עד ארבע "כיפות" / בארות צופו ונותחו לכל מטופל הן עבור ביופסיות גוף קיבה והן ביופסיות אנטרום. אורגנואידים נוצרו בהצלחה מגוף הקיבה ומרקמת ?.......
להלן מתואר פרוטוקול מפורט ליצירה אמינה של אורגנואידי קיבה אנושיים מתאים בודדים שבודדו מביופסיות של אפיתל שפיר מגוף הקיבה והאנטרום. השלבים הקריטיים בפרוטוקול סובבים סביב תזמון, כמו גם טיפול במטריצת קרום המרתף. כדי לשמר את הכדאיות, חיוני להתחיל את הפרוטוקול בהקדם האפשרי לאחר רכישת רקמת הב?.......
אוניברסיטת פנסילבניה רפואה גנומית T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), גברים ותוכנית BRCA במרכז בסר ל- BRCA (KHB, BWK), פרס מענק קרן משפחת גרגוריו (BWK).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
BZ-X710 | Keyence | n/a | |
cellSens | Olympus | n/a | |
Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
DPBS | Gibco | 14200-075 | |
Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel | Corning | 47743-715 | |
Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved